不同海洋生境中PKS基因簇片段的筛选和鉴定.pdfVIP

辽宁-土t 套国蓐译生静鞋术与喀耳南曲学术奎议语文毒 2006．8．2-6 不同海洋生境中PKS基因簇片段的筛选与鉴定 董晓毅，王梁华，孙铭娟，宗荚，焦豫良，焦炳华· 第二军医大学生物化学与分子生物学教研室，上海200433 摘要：目的：为保护和利用我国东海微生物功能基因资源，选择能生物合成聚酮类化合物的I型 聚酮合酶(PKS)基因作为研究对象，考察研究不同海洋生境中PKS基因的分布情况．方法：采集我 国东海沿岸土壤、海水和海底沉积物等不同生境样本，直接提取其总DNA，使用针对I型PKS的酮 酮缩合酶基因片段进行BLAST比对，种系发生分析和功能分析。意义：已经获得的序列不仅可作为 探针，用于海洋宏基因组文库中PKS阳性克隆的筛选，还为新型聚酮类化合物的生物合成厦异源表 达研究打下基础．而且．该研究策略还极大增加了我们获得新型和有价值的次级代谢产物的能力． 关键词：海洋，宏基因组，聚酮合酶基因，PCR，序列分析 海洋是一个极其复杂的生态大系统．孕育了丰富的微生物基因资源。使用传统的微生物分离培养 方法，建立海洋微生物种质基因库十分必要，但无疑杯水车薪，因为占环境微生物总量99％的属于 未获得培养的微生物．对这些微生物种群的研究只能另辟蹊径flI。依靠目前成熟的基因工程技术，从 海洋生境中直接分离、克隆和表达有用的海洋微生物功能基因，是非常实际的选择。其中，合成红霉 素、雷帕霉素和埃博霉素等具有医学治疗价值的次级代谢产物的l型聚酮合酶(polyketidesynthase， PKs)基因很适合作为宏基因组功能基因筛选目标口I。 目前国际通用的技术路线是直接提取某种环境中的总DNA．构建环境宏基因组文库，使用杂交 或PCR方法从中筛选含I型PKS基因的阳性克隆，再对其进行测序得到目的基因序列。目前最典型 的工作就是从土壤宏基因组文库中筛选I型PKS基因p“。在海洋宏基因组研究领域，目前已经在可 产生已知聚酮类化合物的海绵、总草苔虫等海洋无脊椎动物的共生微生物宏基因组文库中筛选到了一 些I型PKS基因”．61。 本研究设计了一套针对I型PKS基因中保守序列的简并引物，针对我国东海海域的沿岸土壤、 海水，沉积物等不同生境中进行I型PKS基因的筛选，考察我国东海I型PKS基因的分布情况，为 今后开发利用海洋宏基因组中生物合成基因资源，最终为开发海洋来源的生物活性药物打下工作基 础。 l材料与方法 1．1样品采集 土壤样本采集自我国东海舟山群岛洋山港岸边50m，采集时间为2005年12月26日，采样深度 月26日，采样深度为海平面下2m-5m。采集量约lO升。 1．2样品处理 土壤样本分装成小份，在处理前置于-20C冰箱。海水样本使用0．22pro的醋酸纤维膜过滤。收集 膜上沉积物分装小份，在处理前置下．20C冰箱。 1．3基因组提取‘7I 取29泥土或沉积物样品(湿重)，同时加入5ml K50p．I，混合均匀．于 DNA抽提缓冲液和proteinase 6‘N 巨宁·土t 套矗瘁洱生●t术与痒洱焉●．，木奎诅卺文毒 2006．8．1-6 相移入新的离心管，加入0．6倍体积异丙醇．于．20℃中沉淀lh。上柱，每次加700止，全部过完后， Tl， 离心lmin，收集管中样品可直接用于PCR． 1．4简并引物设计与有效性验证 PrimerPremier SCRTGS ．3’。反义引物则针对HGTGT模序．共24条，序列为5’一GTSCCSGTSSHYTCSA-3’，已 经委托上海生工合成，并在含I型PKS基因的游动束丝放线菌(Actinosyrmemapretiosum，，产生大环 内酰胺抗生索Ansamitocin)和Strentomyces 从两种放线菌