灰葡萄孢(Botrytis+cinerea)对多菌灵产生抗药性的分子机制研究.pdfVIP

cinerea)对多菌灵 灰葡萄孢(Botrytis 产生抗药性的分子机制研究 刘圣明周明国。 (南京农业大学植保学院，南京210095) 摘要：苯并咪唑类杀菌剂通过与抗药性相关的B-微管蛋白结合，抑制细胞的有丝分裂。大量研究表明，灰葡 萄孢(Botrytis 变为丙氨酸(Ala)。通过对2007年采集、分离获得江苏省南京市的番茄上的3个灰葡萄孢(Botrytiscinerea) 多菌灵均具有抗药性；突变位点和先前报道一致，首次在国内分离到了谷氨酸(Glu)突变为缬氨酸(Val) cinerea)，并且两种突变类型的菌株与乙霉威之间均存在明显负交互抗性。 的新突变类型的灰葡萄孢(Botrytis 关键词：灰葡萄孢；B．微管蛋白；多菌灵抗药性；突变类型 cinema 多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂用于防治由BotrytisPets．引起的番茄灰霉病已有30 多年历史，由于长期频繁的施用此类作用位点单一的内吸性杀菌剂，极易导致目标病菌产生 抗药性。苯并咪唑类杀菌剂通过与病原真菌B．微管蛋白结合，抑制微管功能，阻止细胞有 丝分裂，抑制病原菌生长。病原菌抗药性的产生是由于细胞中控制B一微管蛋白的基因发生 突变，使蛋白三维构象改变，从而失去了与药剂分子的亲和性…。大量研究表明，p-微管 cinerea)产生抗药性的主要原因旧J。本研究进一步证实了这一结论，并首次在国内采集、分 离到灰葡萄孢(Botrytiscinerea)p．微管蛋白基因新突变类型的菌株。 1材料和方法 1．1供试菌株 2007年从江苏省南京市的蔬菜大棚中采集6个番茄灰霉病病果，单独放在纸袋中，带 回室内放置至出现分生孢子，进行单孢分离，共分离到5个灰葡萄孢(Botrytiscinerea) 菌株。 1．2药剂敏感性测定 能生长的为敏感性菌株旧J。 1．3 13-微管蛋白基因的克隆 选取对多菌灵敏感的灰葡萄孢(Botrytis -作者简介：刘圣明(1981一)，男，博士研究生，从事杀菌剂毒理及抗药性研究； 通讯作者：周明国(1954一)，男，教授，博士生导师，主要从事植物病害化学防治研究；E—mail：mgzhou@ njau．edu．cno 202 灰葡萄孢(Botrytiscinerea)对多茵灵产生抗药性的分子机制研究 方法提取供试病原真菌基因组DNA，取5斗l经1．0％琼脂糖(南京大治)电泳检测。 根据GeneBank中已公布的灰葡萄孢(Botrytiscinema)p．微管蛋白的基因序列，设计1 对特异性引物： FATGCGTGAGATTGTATGTArITITllC Bbeta BbetaRCTATFCCTCGCCCTCAATIG 进行特异性扩增。25山反应体系中，LA PCR Inc 全延伸5min。PCR扩增仪的型号为Frc一200TM(BIO—RADUSA)。取5山PCR产物于 1．O％琼脂糖胶上电泳，电极缓冲液为0．5×TAE，标准分子量用DL2000(大连宝生工)。 利用DNA凝胶回收试剂盒(大连宝生工)纯化从琼脂糖凝胶上切割下来的目的片段。 回收纯化的PCR产物用pMDl9-TSimpleVector进行TA克隆，10斗l反应体系包括： I 5¨l Solution 100ng纯化好的外源片段 0．5 Vector txl pMDl9-TSimple E．coli 混匀后10。C水浴12h，转入到200td 板上筛选白色菌落，质粒微量提取试剂盒(爱思进)提取质粒DNA验证阳性克隆。重组 DNA用M13测序引物进行双向测序，由上海生工完成。 1．4序列分析 较所得序列与已知序列的同源性，确定突变位点和突变类型。 2结果与分析 2．1灰葡萄孢对多菌灵和乙霉威敏感性 感(MBCRNPC5)。 表1