菘蓝查尔酮合成酶基因（IiCHS）的克隆及其生物信息学分析.pdfVIP

陕西农业科学2014，60(07)：8一l1，21 ShaanxiJournalofAgriculturalSciences 菘蓝查尔酮合成酶基因(IiCHS)的克隆及其生物信息学分析 韩立敏 ．一，周宏骏 ，王酷之h (1．药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，西北濒危药材资源开发国家工程实验室，陕西师范 大学 生命科学学院，陕西 西安 710062；2．陕西学前师范学院，陕西 西安 710062) 摘 要：类黄酮是植物体内一类重要的次生代谢产物，对植物的生长发育有着重要的调节作用。查尔酮合成 酶是植物类黄酮合成途径的第一个关键酶，在调控类黄酮的生物合成 中起着决定作用。本研究采用RT— PCR方法扩增得到一条菘蓝查尔酮合成酶家族蛋白基因，命名为IiCHS，全长 1273bp，包含一个l194bp的 ORF，编码 397个氨基酸，分析其编码的蛋白质序列显示其属于查尔酮合成酶家族蛋白，定位于胞质中。该研 究不仅有助于分析查尔酮合酶基因的功能，而且还为进一步利用该基因资源改良菘蓝品质奠定 了理论基础。 关键词 ：菘蓝；查尔酮合成酶；基因克隆 ；生物信息学分析 查尔酮合成酶 (chalconesynthase，CHS，EC pMD19一T载体、反转录试剂盒、PCR试剂购 自 2．3．1．74)是植物 III型聚酮合成酶的一种，是类 TakaRa公司，RNA提取试剂盒、胶 回收试剂盒购 黄酮合成途径的关键酶。它催化 1分子4一羟基 自OMEGA。 香豆素辅酶 A和3分子丙二酰A缩合反应，生成 1．2 菘蓝查尔酮合成酶基因(IiCHS)的克隆 查尔酮及其衍生物，进而产生类黄酮 (包括黄酮 提取菘蓝样品总RNA(提取方法参照试剂盒 醇、黄烷酮、花青素苷等)…。现已从郁金香 、 说明书)，反转录成cDNA，作为PCR扩增模板，根 观赏桃 J、苜蓿_4J、黄蜀葵 J、化州柚_6j、何首 据实验室菘蓝转录组数据库中的EST序列拼接 乌 、罗汉果 、决明子[92、盐芥 加]、小麦 “等多 全长，设计 引物，IiCHSF：5 一CAACTGAGTC— 种植物中克隆得到查尔酮合成酶基因。大量研究 CCAGGATGAATG一3 IiCHSR：5 一ATrGATCAT． 表明查尔酮合成酶参与植物生长发育和对逆境响 CAGTGCAGTGCTIG一3，由北京奥科鼎盛生物科 应的诸多生理生化过程，在抗病、抗虫、花色形成、 技有限公司合成。PCR反应体系20 l，包含2 l 损伤修复、紫外线防御以及根瘤形成等方面起着 cDNA、0．5ixlPrimer3(10 M)、0．5 1Primer5 重要的作用 ¨ J。 (10 M)；10 l2×PremixTaq、7 lddH20。 菘蓝(IsatisindigoticaFort．)，在我国南北广 PCR扩增条件为 {98℃ 10 ；52℃ 30s；72℃90 为栽培，是常用药用植物，以根和叶人药，干燥根 S}×30个循环；72oC10min；16℃forever，110V 入药称板蓝根，干燥叶人药称为大青叶，具有清 琼脂糖凝胶(1％)电泳30min检测。回收 目的片 热、解毒、凉血、利咽等功效，广泛应用于流行性感 段，连接至pMD19一T载体，转人大肠杆菌 DH5ct 冒、流行性腮腺炎、流行性乙型肝炎症等症的治 中，筛选阳性菌落，测序。 疗。对菘蓝查尔酮合成酶基因(IiCHS)的克隆和 1．3 菘蓝查尔酮合成酶基因(IiCHS)的生物信息 分析不但丰富了植物查尔酮合成酶基因的研究内 学分析 容，而且为进一步研究该基因的功能及其调控奠 用 DNAStar和 http：／／www．ncbi．nlm．nih． 定了分子基础 。 v／、http：／／W