乙型肝炎病毒YMDD变异核酸检测试剂盒临床应用及与DNA序列测序分析比较.pdfVIP

乙型肝炎病毒YMDD变异核酸检测试剂盒的 临床应用及与DNA序列测序分析的比较 张东华1 何 赏3 徐 岱2 谭 淼3 陈 华3 1．上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海，200025 2．杭州市第六人民医院，浙江，310014 3．上海科华生物工程股份有限公司，上海，200233 摘要使用拉米夫定治疗慢性乙型病毒性肝炎可导致乙型肝炎病毒YMDD变异株的出 现并产生抗药性，准确、简便的拉米夫定耐药株检测对慢性乙型肝炎病人的疗程管理十分必 要。应用上海科华生物工程股份有限公司研制的乙型肝炎病毒YMDD变异核酸检测试剂盒 (PCR一荧光探针法)对434例乙肝血清样本进行检测，与DNA序列测序结果阳性符合率达 100％，阴性符合率达96．2％；在21例样本的乙肝病毒变异检测中，试剂盒比测序分析结果检 测出更多的变异种类。本研究显示YMDD核酸检测试剂盒比测序更加方便，灵敏，准确，适合 临床推广应用。 关键词 乙型肝炎病毒；YMDD变异；核酸检测；测序；MGB探针 的万分之一，而基础和临床研究已经证实，某些核苷 引 言 全球慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者多达3．6YMDD变异株有抑制作用，临床治疗有效r8]。因此 对正在使用拉米夫定治疗的乙型肝炎患者进行 亿，我国占1．2亿。慢性感染者中约50％～75％有 活跃的病毒复制和肝脏炎症改变，部分慢性肝炎可 HBVYMDD变异的检测显得十分重要，这有助于 进展为肝硬化、肝衰竭或原发性肝癌，是主要的疾病 监测肝炎病情、评价抗病毒治疗的效果及调整治疗 死亡因素之一[11。目前已经批准用于临床的抗病毒 方案。 治疗药物有限，公认有效的抗HBV治疗药物主要 目前临床上鉴定耐药突变的可用方法包括 DNA序列测序分析、等位基因特异性PCR分析、分 是干扰素和以拉米夫定(1amivudine，LAM)、阿德福 子杂交、限制性片段长度多态性(RFLP)分析、基质 韦(adefovir)、恩替卡韦(entecavir)等为代表的新 一代核苷类似物。拉米夫定作为第一个获批准的口 辅助激光解吸附电离飞行时间质谱测定法(MAL— 服抗HBV药物，其问世推动了慢性乙型肝炎治疗 的进程[2]，但是随着拉米夫定临床广泛应用，遇到一 基于灵敏性，实用性，方便性等特点，临床上对于 些与以往治疗类似的问题——耐药突变。 YMDD突变的检测多用特异性探针实时PCR 检测。 HBV每24小时可复制约10”～1013个拷贝[3]， 而HBV聚合酶缺乏校正机制，HBV的突变率为 上海科华生物工程股份有限公司研制的乙型肝 炎病毒YMDD变异核酸检测(PCR一荧光探针法)试 (1．4～3．2)×10{核苷酸替代／(位点·年)[4|。于 是HBV在拉米夫定外在选择压力下，积累 剂盒可进行YIDD及YVDD变异的鉴别检测，该试 rtM204I、rtM204V等耐药变异，即YMDD变异[5]。 这将诱发聚合酶活性区的酪氨酸一蛋氨酸一天冬氨 解探针相比，MGB有以下优点：可以使探针的长度 酸一天冬氨酸(YMDD)变为酪氨酸一异亮氨酸一缩短，尤其对AT含量高的序列的MGB探针的设 天冬氨酸一天冬氨酸(YIDD)或者酪氨酸一缬氨酸计有很大的帮助，可提高配对与非配对模板间的 一天冬氨酸一天冬氨酸(YVDD)，使药效急剧下降， 血清HBV—DNA载量升高，病情反复。已有文献报不发光的荧光基团，并且与Report基团在空间的位 道[6‘7]，部分患者使用拉米夫定治疗超过半年以上即 置更接近，使杂交的稳定性大大提高，实验的结果更 发生耐药，耐药一旦