气道平滑肌细胞培养方法探讨_邱晨.pdfVIP

广东医学　2008 年 11月 第 29卷第 11期　 　.2008, .29, .11 ·1791· 气道平滑肌细胞培养方法探讨＊ 邱晨　李 暨南大学第二临床医学院、广东省深圳市人民医院呼吸内科(5 18020 ) 　　【摘要】　目的　建立气道平滑肌体外稳定培养的方法。方法　利用组织贴块法和胶原酶消化法培养大鼠气 道平滑肌细胞, 培养的细胞经形态学和免疫细胞化学染色鉴定。结果　培养细胞呈典型的“谷峰状”生长, 胞浆内 特异性的平滑肌肌动蛋白阳性表达, 符合平滑肌细胞的形态学特征和生物学特性。结论　建立了高纯度、性能稳 定且生长快速的大鼠 体外培养模型, 为相关疾病的研究奠定良好的基础。 【关键词】　气道　平滑肌细胞　细胞培养 　　气道平滑肌细胞 (, 消化法:将组织剪成 1 ×1大小的组织块置于 )是呼吸道的主要组成部分之一,具有重要的生 25 培养瓶中,加入 0.7 ～1 的 0.2%Ⅰ型胶原酶, 理作用。 的异常改变是呼吸道疾病的一个重要 吹打均匀, 37℃消化 30 后,加入含 20%胎牛血清 病理特征,其增殖是气道重构 ()的关 的 培养液,置 37℃, 5%培养箱中半开放式 2 [ 1] 键环节 。 的体外培养为研究其细胞生物学行 静置培养。 为提供了一个有效的平台,是研究相关疾病发病机制 1.2.2　传代培养　原代培养组织块周围爬出的细胞 及其防治手段的重要工具。本研究旨在建立高效、稳 相互汇合,逐渐铺满整个瓶底。此时进行首次传代:吸 定的培养方法,为相关疾病的研究提供可靠的实验材 弃旧培养液, 加入 0.25%胰酶液 (含 0.02%) 料。 1 ～2 ,室温下消化 1 ～2 后镜下观察, 当细胞回 1　材料与方法 缩、间隙增大时, 吸弃胰酶液,加入含 10%胎牛血清的 1.1　材料　150 ～180 雄性大鼠,购自南方医科 培养液 4 ～6 终止消化,反复吹打瓶壁细胞, 大学实验动物中心。 干粉培养基、标准胎牛血 形成的细胞悬液按 1 ∶2 接种入新培养瓶中,半开放式 清购自公司, -干粉购自公 静置培养。原代培养的细胞混有少量的成纤维细胞, 司, 胰蛋白酶粉 (1 ∶250 )购自公司;型胶原 需要进行纯化。成纤维细胞贴壁时间短,细胞消化接 酶购自公司, 鼠抗平滑肌 α肌动蛋白单克隆 种入新培养瓶后静止 30 ,使部分细胞贴壁,转移培 抗体,购自公司;免疫组化试剂盒、显色 养液至另一培养瓶中,再静置、贴壁,重复上述步骤后, 试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。 可获得较纯的 。在培养过程中,数量占优势的 1.2　细胞培养 平滑肌细胞可排挤其他细胞的生长,经过数次传代以 1.2.1　原代培养　取材:10%水合氯醛腹腔麻醉大 后可得到理想纯度的细胞。当细胞增殖旺盛,培养液 鼠, 75%乙醇浸泡消毒 2 , 腹主动脉放血处死。无 由红色变黄时需换液, 吸弃旧培养液,再加入新鲜培养 菌条件下自甲状软骨水平下 2 个气管环分离取出肺、 液 2 ～3 。当细胞铺满整个瓶底以后再进行传代,传 支气管,放入盛有 -液的烧杯中漂洗 3 ～5次, 代周期一般为 3 ～5 。 去除血污及周围组织,转移入另一盛有 -液的 1.3　细胞鉴定 培养皿中, 以 1 注射器针头固定于 6 ×6 大小 1.3.1　形态学观察　应用倒置相差显微镜观察细胞 的橡胶板上,用眼科镊钝端轻轻刮去肺组织,分离出完 大小、形态、生长特点及排列方式等。 整的气管、支气管,再用细结镊