人HSV-1+UL40基因重组质粒的构建及其在siRNA筛选中的应用.pdfVIP

维普资讯 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2007，23(12)：2444—2447 [文章编号] 1000—4718(2007)12—2444—04 人 HSV一1UIA0基因重组质粒 的构建及 其在 siRNA筛选 中的应用 任 哲 ， 张美英 ， 王一飞 ， 朱钦 昌 ， 张春龙 ， 陆大祥 ， 胡巢凤’， 李久香 ， 张佩琢 ， 杨志荣 (四川大学生命科学学院，四川 成都610000；暨南大学 生物医药研究与开发基地 ， 医学院，广东 广州 510632；上海吉玛制药技术有限公司，上海201203) 【摘 要】 目的：快速筛选出高效沉默人HSV一1UIAO基因的siRNA，为进一步应用RNA干扰的相关研究 奠定基础。方法：应用RT—PCR扩增人HSV一1F株UL40基因，将其连接到pEGFP—N1构建pEGFP—N1一UL40 融合蛋白表达质粒。将化学合成的针对UL40基因的siRNA与重组质粒共转染Veto细胞 ，通过观察绿色荧光蛋白 报告基因的表达筛选高效沉默人HSV一1UL40基因的siRNA。结果：倒置荧光显微镜观察发现设计的4对siRNA 中siRNA3和siRNA4能明显降低绿色荧光蛋白的表达，流式细胞仪检测证明siRNA3和siRNA4对 目的基因沉默效 率分别达到76．99％和84．0o％ 。结论：成功构建了人HSV一1UL40基因融合表达载体 pEGFP—N1一UL40，并利 用该载体筛选出2对高效沉默人HSV一1UL40基因的siRNA。 [关键词] 疱疹病毒I型，人；基因，UL40；siRNA [中图分类号] Q78 [文献标识码] A ConstructionofhumanHSV -—1UIA0generecombinantand itsapplica- tionin siRNA screening REN Zhe ，ZHANG Mei—ying2 WANGYi—fei，ZHUQin—chang2，ZHANGChun— ， long ，LUDa—xiang，HU Chao—feng，LIJiu—xiang ，ZHANG Pei—zhuo，YANG Zhi—rong (。CollegeofLfieSciences，SichuanUniversity，Chengdu610000，China；BiomedicineResearchandDevelopmerttCenterof JinanUniversity，MedcialColelgeofJinanUniversity，Guangzhou510632，hCina；ShanghaiGencPharmaCo．，Ltd， Shanghai201203，China．E—mail：twangyf@jnu．edu．cn) [ABSTRACT] AIM ：ToconstructtherecombinantofhumanherpesvirnsI(HSV一1)UL40geneandtoscreen siRNAsofsilencingefficientlyhumanHSV一1UL40 geneexpression．METHODS：TherecombinantUL40一EGFPplas- mid(pEGFP—N1一UL40)wasconstructedbycloningtheUL40geneintopEGFP—N1．siRNAtargetUL40geneand pEGFP—N1一UL40werecotransfectedintoVerocells．TheeffectsofRNAiweredetectedbygreenfluorescencesignals． RESULTS：siRNA3，siRNA4reducedprominentlytheexpressionofUL40gene．Th esilenceefficiencywas76．99％ and 84．0o％ respecti