人端粒酶逆转录酶慢病毒载体的构建及人肝细胞的初步筛选.pdfVIP

· 826 · 理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2009，25(4)：826—829 [文章编号] 1000-4718(2009)04—0826—04 · 实验技术 · 人端粒酶逆转录酶慢病毒载体的构建及 人肝细胞的初步筛选术 梁旭竞 ， 陈小佳 ， 金 玲 ， 李丽玲 ， 汤绍辉 ， 陈友鹏 ， 杨冬华 (暨南大学附属第一医院 消化科，眼科，感染科 ；暨南大学生物工程研究所，广东 广州510632) [摘 要】 目的：构建人端粒酶逆转录酶 (hTERT)慢病毒表达载体，将其转染人肝细胞 I2)2并且通过杀稻瘟 筛选出阳性克隆细胞。方法：以PBABE—puro—hTERT质粒为模板PCR法获取 目的基因attB1一hTERT—attB2，通 过 BP反应克隆至 pDONR221；采用 LR重组酶将 pDONR221一hTERT和 pLenti6／V5一DEST进行重组反应 ，形成 pLenti6／V5一DEST—hTERT。将重组载体pLenti6／V5一DEST—hTERT与包装质粒充分混合，利用脂质体共转染 293FI细胞，获得重组慢病毒颗粒。将其感染人肝细胞 L02，通过杀稻瘟筛选获得 阳性克隆。结果：测序发现入门 载体pDONR221包含的目的基因hTERT1547位点存在点突变 (原碱基A变成 G)，通过定点突变技术成功诱变并 鉴定慢病毒表达载体pLenti6／V5一DEST—hTERT成功构建。重组慢病毒滴度为 1×10TU／L，获得20株稳定抗 性的单克隆细胞。结论：成功构建人端粒酶逆转录酶的慢病毒表达载体，获得稳定抗性的单克隆肝细胞，为进一步 建立永生化肝细胞系奠定了基础。 [关键词] 端粒酶逆转录酶；慢病毒载体；肝细胞 [KEYWORDS] Telomerasereversetranscriptase；Lentiviralvector；Hepatocytes [中图分类号] R318．14 [文献标识码] A 急性肝功能衰竭病情凶险，死亡率高达90％…，唯一有 效的治疗措施是肝移植。然而，由于供肝匮乏，并且肝移植 材 料 和 方 法 本身有相当高的死亡率，人工肝支持系统作为一种替代疗法 1 材料 从 20世纪50年代开始逐渐发展起来。生物型人：亡肝因其具 PBABE—puro—hTERT质 粒 由 RobertWeinberg教授 有多种类似 自然肝的功能及作用作为当前理想的人工肝治 (TheWhiteheadInstituteforBiomedicalResearch，atMassaehu— 疗方法。目前大部分的生物人工肝使用猪肝细胞作为细胞 settsInstituteofTechnology，USA)惠赠；质粒 pDONR221、 组分，但猪肝细胞含有内源性逆转录病毒和潜在的引起异种 pLenti6／V5一DEST、ccdBsurvival、Stbl3及 293FT细胞 由暨南 蛋 白反应的可能，因此未来的生物型人工肝只有选用人源性 大学生物工程研究所提供；L02肝细胞购 自中科院上海细胞 肝细胞作为细胞组分的来源才能获得最终的成功。然而，原 生物研究所；SacI、XhoI等限制性内切酶、Pfime~tra及DNA 代人肝细胞来源受限，体外培养增殖缓慢，功能维持时间短， 分子量标准购 自大连 TaKaRa公司；BP酶 、LR酶、Lipo- 限制了其应用