稳定表达人巨细胞病毒蛋白pUL23细胞系建立及其功能研究.pdfVIP

· 966 · 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophY gy !Q (!； =竺ZQ [文章编号] 1000—4718(2010)05—0966—05 稳定表达人 巨细胞病毒蛋 白pUL23 细胞系建立及其功能研究 杨丹丽， 肖小平， 宫君原， 员月明， 李月琴， 张 欣， 邹 弈， 周天鸿 ， 李弘剑△ (暨南大学生命科学技术学院生物工程学系，广东 广州 510632) [摘 要] 目的：建立稳定表达人巨细胞病毒 UL23基因的HELF细胞系，研究病毒蛋 白在宿主细胞内行为， 为进一步研究人巨细胞病毒蛋白pUL23的功能提供依据。方法：通过 PCR技术从人巨细胞病毒基因组中扩增出 UL23基因，通过分子克隆技术构建重组逆转录病毒表达载体pLEGFP—N1一FLAG—UL23。将该载体导入 Am— phoPack 一293细胞，收获重组逆转录病毒，然后感染 HELF细胞 ，HELF经持续 G418抗性筛选后获得稳定表达 UL23基因的细胞系。采用激光共聚焦显微镜观察病毒蛋 白在细胞 内的定位。结果：RT—PCR、Westernblotting结 果证实病毒基因UL23能够整合到宿主细胞基因组中，并能在宿主细胞中稳定表达病毒蛋白。共聚焦显微镜观察 到病毒蛋白pUL23定位于细胞质，处于细胞核周边。结论 ：利用逆转录病毒载体介导的基因转移技术，成功构建了 稳定表达 UL23基因的转基因细胞系。该病毒蛋白在宿主细胞质中的定位 ，提示病毒蛋 白发挥功能的空间位于细 胞核周边 ，有利地推进了人巨细胞病毒蛋 白pUL23功能研究的进程。 [关键词] 巨细胞病毒；基因，UL23；逆转录病毒 [中图分类号] R363 [文献标识码] A doi：10．3969／j．issn．1000—4718．2010．05．027 StudiesonthehumancytomegalovirusproteinpUL23byestablishmentof HELF celllinestablyexpressingpUL23gene YANGDan—li，XIAOXiao—ping，GONGJun—yuan，YUANYue—ming，LIYue—qin， ZHANGXin，ZOUYi，ZH0UTian—hong，LIHong—iian (DepartmentofBiotechnology，CollegeofLifeScienceandTechnology，JinanUniversity，Guangzhou510632，China．E— mail：tzth@ H．edu．ca，tlihj@jnu．edu．cn) A『BSTRACT] AIM ：ToestablishHELFcelllinewithstableandeffectiveexpressionofhumancytomegalovirus (HCMV)UL23geneasapowerfultooltostudythesituationofviralproteinsinhostcellsinvitro．METHODS：UL23 genewasamplifiedbyPCRfrom HCMV andthenrecombinantplasmidpLEGFP—N1一FLAG—UI23wasconstructedby molecularcloningtechniques．ArtificialretroviralvirusescontainingHCMV UL23genewereobtainedbytransferringplas— midDLEGFP—N1一FLAG—UL23intotheAmphoPack。 一293packageceils．TheHELFcellswereinfectedbytheartifi— cialretroviralparticles．ThepositiveHELFcellswhichstablyexpressedtheUL23wereobtainedbyG418selection．Thelo— cationoftheviralprotei