小鼠心肌微血管内皮细胞的原代培养及生物学特性.pdfVIP

国痘理生理 盔 Ch—ine—seJournalofPathophysiology 2013，29(3)：565-570 · 565 · [文章编号] 1000-4718(2013)03—0565．06 · 实验技术 · 小鼠心肌微血管 内皮细胞的原代培养及生物学特性 辛 毅，许秀芳，黄益民，张 颖，李温斌，李 娜 (首都医科大学附属北京安贞医院，北京市心肺血管疾病研究所分子生物学研究室，北京 100029) [摘 要] 目的：探讨一种高效、稳定的从小鼠心肌组织中分离培养心肌微血管内皮细胞的方法并观察细胞 的生物学特性。方法：以多聚赖氨酸对培养皿作预包被，采用 Ⅱ型胶原酶消化、差速贴壁分离法，结合内皮细胞专 用培养基，分离培养微血管内皮细胞并进行扩增 。利用倒置显微镜观察细胞生长情况；台盼蓝法、绘制生长曲线和 MTI法分别测定心肌微血管内皮细胞传代成活率、不 同代生长及增殖特征；以Dil．ae，LDL和FITC．UEA．1荧光双 标，结合CD31、vWF和CD34免疫荧光鉴定细胞表面特异性抗原；体外血管形成实验检测心肌微血管内皮细胞的功 能。结果：酶消化、差速贴壁法分离培养2d后，细胞呈散在的、小簇状聚集性生长，4～5d迅速生长呈单层排列， 细胞为梭形、三角形或多角形 ，7—8d后呈铺路石样即可传代；传代细胞经台盼蓝法检测成活率均为95％以上；第 1、3代细胞生长曲线近似 “s”形 ，MTF法显示第 1、3代细胞在第2—4d吸光度变化较明显 (P0．05)；随传代次数 的增加 ，第5代细胞生长曲线近似平缓 ，吸光度无明显变化，细胞逐渐衰老 ；DiI．ac—LDL和FITC．UEA．1荧光双标阳 性率为(89．2±3．5)％，相关特异性抗原 CD31、vwF和 CD34免疫荧光鉴定阳性率为(56．7±3．7)％、(78．5± 2．6)％和(67．8±4．2)％；体外血管形成实验显示，6—12h后出现明显的管腔结构。结论：以多聚赖氨酸作预包 被，采用 Ⅱ型胶原酶消化、差速贴壁法并结合内皮细胞专用培养基，可获得纯度较高的小鼠心肌微血管内皮细胞 ， 为心脏疾病的研究提供种子细胞。 [关键词] 心肌微血管内皮细胞 ；原代细胞培养 ；生物学特性；小鼠 [中图分类号] R332 [文献标志码] A doi：10．3969／j．issn．1000—4718．2013．03．033 Biologicalcharacteristicsofprimarily culturedmicrovascularendothelial cellsinmousemyocardiam XIN Yi，XU Xiu-fang，HUANG Yi—min，ZHANG Ying，LIWen—bin，LINa (DepartmentofMolecularBiology，BeijingAnzhenHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity，BengInstituteof Heart， BloodVesselDiseases，Be ng100029，China．E—mail：Lina82002@yahoo．com) [ABSTRACT] AIM：Toinvestigateaneffectiveandstablemethodtoisolatemyocardialmicrovaseularendothelial cells(MMVECs)from themouseheartandtoobservetheirbiologicalcharacteristics．METHODS：Thecellsfrom the mouseheartwereisolatedbyeollagenaseIIdigestionfollowedbydifferentspeedadhesion．Thenthecellswereculturedon thedishcoatedwithpolylysineinendothelialcel1specificculturemedium