携带红色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒载体的构建及其体外试验研究.pdfVIP

理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 201l，27(Q)； 二 墨 · 2045 · [文章编号] 1000—4718(2011)10—2045—04 携带红色荧光蛋 白报告基因的 重组腺病毒载体的构建及其体外试验研究 卢建溪 ， 阳 莉 ， 钱师宇 ， 王 强 (中山大学附属第三医院疫苗研究所，广东 广州510630；暨南大学医学院，广东 广州 510632) [摘 要] 目的：采用体外连接技术构建含红色荧光蛋白(RFP)报告基因的重组腺病毒载体 ，为基因治疗与 基因疫苗研究提供重要工具。方法：将pTurboRFP—N上的含 R 基因片段，经酶切连接定向克隆至转移载体 pShuttle上，构成重组质粒pShutde—TurboRFP—N。用 I—CeuI／PI—SceI双酶切重组质粒pShutfle—TurboRFP—N 和骨架质粒pH5400pkGFP—II，回收目的片段，连接 ，获得重组腺病毒载体 AdH5’．400．CMV．RFP—N。将其线性 化后，经脂质体介导转染至AD293细胞内包装出重组腺病毒颗粒。通过荧光显微镜观察其在AD293细胞内的包 装效率和 RFP表达情况。扩增并再次感染AD293细胞检测病毒颗粒感染能力，并测定其生物活性及滴度。将所 构建的重组腺病毒载体AdH5’．040．CMV．RFP—N与对照腺病毒载体AdH5．CMV．EGFP在体外感染人肺癌细胞系 A549和乳腺癌细胞系MDA—MB一231。通过荧光蛋白RFP和EGFP的表达，比较它们对以上肿瘤细胞的感染效 率。结果：经酶切鉴定，证明已正确构建重组腺病毒载体AdH5’．040．CMV．RFP—N；经AD293细胞包装成具有感 染性的病毒颗粒，并能在真核细胞中高效表达 目的基因；扩增纯化后获得重组腺病毒颗粒数为3．6×10vp／L，滴 度达 1．8×10”pfu／L。重组腺病毒载体 AdH5’．400．CMV．RFP—N感染人肺癌细胞系A549和乳腺癌细胞系 MDA — MB一231的感染效率 ，高于对照腺病毒载体AdH5．CMV．EGFP(P0．05)。结论：成功构建了携带R ’报告基 因的重组腺病毒载体 ，并能够在AD293细胞 中高效地表达，对肿瘤细胞的感染效率高。RFP对 GFP是一种很好的 代替和补充，为基因治疗与基因疫苗研究提供更多的荧光标签。 [关键词] 腺病毒载体；红色荧光蛋白质 ；基因重组 [中图分类号] R363 [文献标识码] A doi：10．3969／j．issn．1000—4718．2011．10．038 ConstructionandinvitroanalysisofrecombinantadenovirUSvectorcar． ryingredfluorescentproteinreportergene LUJian—xi，YANGLi，QIANShi—yu，WANGQiang (VaccineResearch m ，TheThirdAffiliatedHospital，SunYat—senUniversity，Guangzhou510630，China；School ofMedwine， 抛nUniversity，Guangzhou510632，hCina．E—mail：lx／3005@yahoo．com．cn) [ABSTRACT] AIM：Toprovideimportanttoolsforgenetherapynadgenevaccineresearchbyconstructingall adenovirusvectorcontainingrodfluorescentprotein(RFP)reportergenewiththeapproachofinvitrorecombinantligation． METHODS：TheRFPgenefragmentofpTurboRFP—N WaSdigestedandligatedintopShuttletralnsf_ervectortoconstruct recomb inantve