重组色素上皮衍生因子对人视网膜微血管内皮细胞迁移及凋亡的影响.pdfVIP

· 224O· 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2010，26(11)：2240—2245 [文章编号】 1000—4718(2010)11—2240—06 重组色素上皮衍生因子对人视网膜微血管 内皮细胞 迁移及凋亡的影响 李 涛， 李加青， 罗 燕， 马红婕， 丁小燕， 袁 玲， 马 伟， 胡旭颞， 万 婷， 唐仕波 (中山大学中山眼科中心，眼科学国家重点实验室，广东 广州510060) [摘 要] 目的：构建rAAV2一PEDF腺相关病毒，研究色素上皮衍生因子(PEDF)基因高表达对人视网膜微 血管内皮细胞的作用。方法：将PEDF基因克隆、重组到腺相关病毒载体pSNAV，得到的pSNAV—PEDF后转染 BHK细胞，用含G418的培养基进行筛选，得到稳定转染pSNAV—PEDF的生产细胞系，用重组 1型单纯疱疹病毒 HSV1一rc／AUL2感染细胞进行病毒包装，纯化后得到高滴度rAAV2一PEDF病毒颗粒。按照l0v．g．／cell的剂量 进行rAA~2一PEDF病毒转染，分别设空白和阴性对照，激光共聚焦显微镜下观察 GFP阳性细胞，Westernblotting 检测PEDF蛋白表达。Boyden小室法观察细胞迁移情况，流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果：通过PCR、酶切及 基因测序的方法，证实rAAV2一PEDF构建成功。转染病毒48h后，激光共聚焦显微镜下观察可见GFP阳性细胞， Westernblotting检测，实验组PEDF表达明显强于其它组。rAAV2一PEDF干预正常氧条件下人视网膜微血管内皮 细胞 ，正常对照组凋亡细胞 比例为2．10％4-0．53％，rAAV2一GFP组为3．4o％ ±0．62％，rAAV2一PEDF组为 1．60％±0．47％，各组间无显著差异(P0．05)。rAAV2一PEDF干预低氧条件下人视网膜微血管内皮细胞，单纯 CoC12组凋亡细胞比例为4．00％±0．55％，CoC12+rAAV2一GFP组为6．10％-4-0．71％，CoCI2+rAAV2一PEDF组为 4o．oo％-42．10％。rAAV2一PEDF组与其它2组相比，有显著差异(P0．05)。细胞迁移计数显示，正常对照组为 33．0±2．7，rAAV2一GFP组为35．0±3．6，rAAV2一PEDF组为 12．0-42．1，rAAV2一PEDF组与其它2组相比，有显 著差异 (P0．05)。结论：成功构建了rAAV2一PEDF，转染人视网膜血管内皮细胞后PEDF可稳定表达。PEDF高 表达可显著抑制人视网膜微血管内皮细胞迁移并可在低氧条件下诱导其凋亡。 [关键词】 腺相关病毒；转染；细胞迁移；细胞凋亡；流式细胞术 [中图分类号] R363 [文献标识码】 A dDj：10．3969／j．issn．1000—4718．2010．11．031 EffectofrAAV2——PEDF onmigration and apoptosisofhuman retinal capillaryendothelialcells LITao，LIJia—qing，LUOYan，MAHong—jie，DINGXiao—yan，YUANLing，MA Wei，HU Xu—ting，WAN Ting，TANG Shi—bo (StateKeyLaboratoryofOphthalmology，ZhongshanOphthalmicCenterofSunYat—senUniversity，Guangzhou510060， China．E—mail：tangsb@mail．sysu．edu．cn) [ABSTRACT] AIM：ToconstructarAAV2一pigmentepithelium—derivedfactor(PEDF)vectorandtoexplore theeffectofrAAV2一PEDFonthemigrationandapoptosisofhumanretinal eapiBaryendothelialceils(HRCECs)． METHODS：PEDFgenewascl