探讨原位杂交HPV+DNA检测技术应用.pdfVIP

201 1年全国病理技术新进展研讨会论文汇编 入10ml 液振荡混匀后离心，倒出上清液，加入Thinprcp保存液，振荡混匀，15min后经新柏氏TCT 微电脑处理系统制成超薄细胞涂片。95％的乙醇固定15rain，HE染色、封固、镜检。将剩 余在保存液中的标本保留，已被再次制片。 2结果 制成的涂片为直径1．3cm的圆形薄层物，于传统的涂片相比，TCT细胞涂膜面积小， 细胞分布均匀，涂片背景干净，红细胞大多破坏消失，异常细胞清晰可见，细胞无退化变性， 颜色鲜艳，层次分明，核膜、核仁及染色质清晰可见，三维立体感好。 3讨论 胸腹水标本制片受到胸腹水的新鲜程度、细胞数量、退变程度、血细胞含量多少、涂片 厚薄、固定状态以及染色情况等因素的影响。传统普通制片技术常含有大量红细胞、炎性渗 出物及粘液混杂在一起，造成背景不清晰；同时普通手工涂片，细胞厚薄不均匀，细胞多层 重叠较为严重，有些阳性细胞甚至被干扰细胞所覆盖，并且结构不清，细胞受机械力的作用 发生人为的变化，涂片面积大而敏感性较低。 利用新柏氏TCT检测技术制作的单层细胞涂片背景清晰，被检细胞集中，容易阅片。 与传统普通制片方法比较，TCT检测技术改善了样本的收集方法，使细胞均匀分布在载玻 片上，不仅除去了粘液、红细胞及炎性渗出物，而且保存了细胞的完整无损，同时保全细胞 的抗原生物特性，对免疫组化染色无任何影响，有利于肿瘤细胞的鉴别诊断。当需要重复制 片和进行免疫组化标记时，不需要再次采集标本，用剩余在保存液瓶中的标本即可制片。 新柏氏TCT技术明显改进了细胞涂片的质量，降低了漏诊和误诊率。虽然涂片的面积 比传统涂片的面积缩小了，但细胞的总体采集量却大大的增加了，可将收集到的细胞全部采 集到玻片上，同时读片面积缩小，细胞集中，利于仔细的阅片。另外，一次收集胸腹水标本， 可以多次制出相同地超薄涂片，以便进一步进行免疫组化标记和DNA检测。 新柏氏TCT技术不仅变革了标本采集和处理方法，而且获得优良的制片质量和满意的 观察效果，有利于提高胸腹水恶性肿瘤的细胞学诊断率。 121．探讨原位杂交HPVDNA检测技术的应用 郝志伟王玉萍曹静张欢欢 郑州大学第三附属医院 原位杂交技术是近年来开展的一项新技术采用荧光、生物素、地高辛等标记的探针，利 用碱基对互补配对的原理，与组织标本中的靶序列特异杂交，经信号放大显色后镜下观察结 果。该方法具有很高的灵敏性和特异性。本文就HPVDNA检测技术在日常工作中的操作体 会等问题做一总结。 l材料与方法 1．1 材料郑州大学第三附属医院妇科宫颈活检标本。试剂为泰普公 司的HPV高危型、低危型试剂盒。 1．2 方法 1．2．1 切片的处理将3微米厚的组织切片粘附在含有正电荷的粘 附性载玻片上，放置在65℃的恒温箱中烤2小时，常规二甲苯脱蜡入水，蒸馏水充分洗涤， 将切片放入盛有杂交增强液的容器内，微波高火状态下煮30分钟，冷却至室温，蒸馏水洗 238 2011年全国病理技术新进展研讨会论文汇编 片2次。 1．2．2 杂交 1 擦干切片，滴加探针25微升并加盖盖玻片。 2 把切片放置在95℃的杂交加热器上变性5分钟。 3 放入装有30％湿盒增效液的湿盒中。 1．2．3 信号放大与显色 1 滴加一抗50微升，37℃湿盒中孵育30 升，镜下观察显色情况，PBS终止显色。 5 自来水冲洗，苏木精复染，盐酸乙醇进行分化， 返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明封固。 1．2．4阳性结果判断细胞核呈棕褐色着色为主。 2讨论 HPV属于乳头瘤病毒科，是一种环状双链DNA病毒，其主要通过直接或性传播感染人 类，引起皮肤和粘膜乳头状瘤或疣，某些亚型具有很强的致癌性。随着分子技术的发展，我 们可以从分子的水平更早期、更准确地检测出低拷贝数下的病毒感染情况。该技术被广泛应 用于宫颈癌的早期诊断。 原位杂交检测技术虽然容易掌握，但要达到满意结果，还需在操作过程中注意以下几点： 2．1 前期处理 1 组织固定液应采用10％的中性甲醛或4％的多聚 甲醛磷酸缓冲液。 2 切片厚度3微米， 3 烤片温度65℃2小时到3小时， 4 使用带有 正电荷的粘附性载玻片，以减少脱片的发生。 2．2 操作要点 1 二甲苯要及时的更换，保证组织脱蜡完全、干 净。 2 微波处理需高火档，持续30分钟以上。期间要注意补充杂交增强液，防止干片。 3 如使用酶消化处理，要根据不同的组织、组织存放的时间不同以及切片的厚度不同需 要进行真对性的摸索酶消化的最佳条件。 4 盖玻片要与组织的大小相匹配，防止高温变形 过程中不干片。 5 建议使用专用的原位杂交仪和变性设备，以保证变性温度的准确。 6 杂交温度应保持在37。C，