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Klotho基因多态性与衰老的相关性研究 　　[摘要] 目的 研究Klotho基因多态性与中国汉族人群衰老的关系。 方法 在482例（60岁236例，60岁246例）沈阳地区健康汉族人群，采用Snapshot（微测序） 的方法检测Klotho基因标签SNP（TagSNP）-rs571118位点和功能SNP位点rs9536314（F352V），rs9527025（C370S）的基因型，观察Klotho基因多态性与衰老的关系。结果 证实在中国汉族人群F352V（rs9536314）为G纯合子，C370S（rs9527025）为T纯合子；rs571118位点存在AA，GG，AG基因型。老年人群基因型分布为（AA35（14.22），AG132（53.65），GG79（32.11）），年轻人群基因型分布为（AA51（21.61），AG128（54.23），GG57（24.15））。Klotho基因rs571118位点G等位基因频率在老年人群高于年轻人群。结论 Klotho基因rs571118位点多态性与衰老存在明显相关。 　　[关键词] 衰老；Klotho基因；单核苷酸多态性 　　[中图分类号] R394 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）10-09-03 　　遗传因素在衰老中起到重要作用[1]，而基因是遗传信息的载体和遗传物质的最小功能单位。衰老学家们认为，衰老并非单一基因决定，而是一连串基因激活和阻抑及各自产物相互作用的结果。内、外环境，如氧自由基等损伤因素都可以影响DNA（特别是线粒体DNA）的稳定性，加速衰老进程。衰老时人体机能下降，对疾病的易感性增强。而基因多态性位点的变化，可能影响基因的表达水平，进而影响蛋白质的功能。弄清衰老基因的功能、调控、影响因素可能是弄清衰老机制的一条重要途径。Klotho是一种抗衰老基因。Klotho作为一种辅助因子/复合受体调节成纤维细胞生长因子（FGF）23信号，影响细胞内信号通路包括p53/p21，cAMP，蛋白激酶C（PKC）和Wnt信号通路。Klotho保护内皮的机能障碍和调节一氧化氮的产生，Klotho基因表达增加，能通过 　　抑制胰岛素信号和氧化应激进而抑制衰老和延长寿命[2]。人类Klotho基因的多态性相关于多种衰老相关疾病和紊乱的易感性增加。在1187白种人的研究中发现，在启动子区域（G-395A）和一个外显子4（C1818T，）的单倍型和老年绝经后妇女的骨质密度显著相关[3]，在韩国的研究发现，年龄差异影响Klotho G-395A和C1818T多态性与CAD的关联性[4]。本研究对Klotho基因基因多态性与沈阳地区中国健康汉族人群衰老的的关系进行了研究，现报道如下。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　选取2008年10月～2009年5月志愿者，男669例和女684例，经过查体，询问病史、血尿常规、血生化、胸片、腹部超声、心血管超声、肺功能的检查，筛查出482例“健康”志愿者，均为沈阳市汉族居民，其中男228例，女254例，年龄35～91岁。 　　1.2 主要仪器和试剂 　　-80℃冰箱（SANYO Japan）；高速低温离心机（Sigma USA）；ABI 3730xl DNA测序仪（ABI USA）；凝胶自动成像及分析系统Chemi Imager 5500（Alpha Innotech USA）。 　　1.3 方法 　　1.3.1 血标本采集 所有研究对象抽取清晨空腹外周静脉血3 mL，2000 rpm离心15 min，弃上清，取血凝块储存于-80℃冰箱内备用。 　　1.3.2 基因组DNA的提取 取血凝块，使用天根RelaxGene Blood DNA System血液基因组DNA提取系统提取基因DNA，按试剂盒说明操作。 　　1.3.3 Klotho基因SNP位点的选取 在Hapmap数据库中下载Klotho基因的中国汉族人群的SNP基因型和等位基因数据，用Haploview软件进行分析选择tagSNP rs571118位点和两个功能SNP位点rs9536314（F352V），rs9527025（C370S）。选定SNP位点后，首先用30个DNA样品进行基因型分析，SNP位点杂合度大于5%则进行大样本的基因型鉴定。 　　1.3.4 Snapshot检测及测序 使用Snapshot（ABI）试剂盒进行单碱基延伸反应。反应体系：3μL Snapshot mix；2μL延伸引物以；l μL纯化的PCR产物。循环参数：96℃预变性1 min，96℃变性10 s，52℃退火5 s，60℃延伸30 s，共28个循环。微测序产物中加入1U SAP，37℃孵育60 min，75℃再孵育15 min，进行纯化处理，