引经药牛膝促进骨髓干细胞定向归巢治疗股骨头坏死的实验研究.pdfVIP

基质细胞衍生因子 (stromal-derived factor, SDF)-1 抗体、SABC 检测试剂盒购自武汉博士德 公司。其他试剂均为国产分析纯。 1.3 模型制备和分组 健康成年日本大耳白兔 48 只，随机分成 4 组，每组 12 只，即伪手术组、模型组、活骨 Ⅱ组、活骨Ⅱ方+牛膝组。除伪手术组外，其他组均通过液氮冷冻左侧股骨头方法建立兔股 骨头坏死模型[6]，即 3%戊巴比妥钠 30 mg/kg 耳缘静脉注射麻醉，无菌操切开皮肤、皮下组 织、深筋膜；分离直达髋关节囊，“T”形切开髋关节囊，不剪断圆韧带，使股骨头半脱位状， 用干纱布围绕以保护股骨头以外的组织，用相当大小的纱布团蘸液氮，即刻冷冻股骨头上端， 持续 3min，用生理盐水将股骨头复温后复位，缝合切口各层。伪手术组仅使股骨头暴露而 不冷冻股骨头。造模所有动物同时皮下注射 rhG-CSF 30μg/kg·d，连续 7 天，活骨Ⅱ和活骨 Ⅱ方+牛膝组立即分别给予活骨Ⅱ方、活骨Ⅱ方+牛膝 15g 灌胃（6g·kg-1·d-1 ），连续4 周；伪 手术和模型组灌胃同体积生理盐水。术后所有动物肌注青霉素钠 20 万 U ，连续 7d，预防感 染。取材前 3 天实验动物腹腔注射 BrdU 50mg/kg ，连续 3 天。 1.4 外周血白细胞计数（White blood cell, WBC ） 皮下 注射前、注射后 、 、 天耳缘静脉取血 20µl ，溶于4ml 稀释液中。采 rhG-CSF 3 5 7 用全自动生化仪测量动物外周血白细胞计数，观察不同时间点白细胞数量。 1.5 血清骨钙素和 BMP2 的表达 2 和 4w 后，心脏采血，常规分离血清，按照 BGP 放射免疫试剂盒的标准流程，进行 放射免疫检测。按照 ELISA 试剂盒说明，检测 BMP2 血清水平。 1.6 组织病理学观察 给药的 2 和 4 周后，每组 4 只动物处死取左侧股骨头，4%多聚甲醛溶液固定 72h，5% 盐酸甲酸溶液脱钙，梯度酒精脱水，常规石蜡包埋、切片，行 HE 染色。光镜下观察 HE 染 色后股骨头骨细胞、骨小梁、软骨细胞、髓内脂肪细胞等结构；高倍镜下随机选取 5 个视野， 每个视野内计数 50 个骨陷窝，计算空骨陷窝的百分比。根据文献报道[7-9] 同时满足以下条件 方可判定模型成功：骨小梁上弥漫分布的空骨陷窝或骨细胞核固缩，临近的骨髓细胞及基质 坏死。 1.7 股骨头 BMP2 的表达 石蜡切片脱蜡至水，3%双氧水处理，蛋白酶 K 消化，预杂交后，加入标记探针，40 ℃ 湿盒中杂交过夜。杂交后梯度 SSC 洗涤，封闭，顺序滴加一抗和二抗，PBS 洗涤，DAB 显 色，封片后显微镜下观察 mRNA 表达分布情况。以 PBS 代替探针作阴性对照。在 200 倍光 镜下采集图像, 每个标本取 3 个不同的视野, 使用 SPOT MIS 图像分析软件搜集每个视野中 阳性细胞计数。 1.8 股骨头 BrdU 和 SDF-1 的表达 取组织石蜡切片，脱蜡至水，对于 BrdU 染色，1N 盐酸 40 ℃作用 1h，PBS 洗涤后 0.04% 胰酶消化 40 ℃ 20min ，以破坏DNA 结构，后用 3 %双氧水处理，37 ℃复合酶消化。PBS 洗 涤，血清封闭，滴加Ⅰ抗，置 4 ℃过夜，用即用型 SABC 检测试剂盒进行股骨头内 SDF-1 表达。SDF-1 的检测水化后直接进入 3 %双氧水处理，余步骤同上。应用 SPOT MIS 图像处 理分析系统，在 200 倍视野下，进行阳性细胞计数和灰度分析。 1.9 统计学方法 — 数据以均数±标准差（x±s ）表示，组间比较用单因素方差分析，采用 SPSS 13.0 软件进 行统计分析，P0.05 表示差异具有统计学意义。 2 实验结果 2.1 骨髓干细胞动员情况 454 如图 所示，经注射 动员后，外周血 数量明显升高，且随着给予 1 rhG-CSF WBC