P13K%2fAkt信号转导通路在ALV-J感染中作用的初步研究.pdfVIP

$--届全国禽病分子生物技术青年学者论坛论文集 1引言 禽白血病(Avian leukosisvirus，ALV)引起的以禽类造血组织中某些细胞成分过度增生为主的一类可传染的肿瘤性疾 病【¨。根据病毒中和试验、宿主范围以及囊膜糖蛋白的特性等，将ALV划分为A．Jlo个亚群21。到目 前为止，我国分离和鉴定的ALV有A、B和J亚群，均属于外源性ALV，其中J亚群ALV引起的病例最 纠3巧l。如何防控ALV是我国禽业生产亟待解决的问题，有着迫切的现实意义。但ALV的侵袭机制仍 十分不清楚，开展ALV-J感染宿主细胞的机制研究可为ALV防控提供一定的理论指导。 病毒感染并在宿主体内生存和复制，主要依赖丁：其对宿主细胞信号转导通路的调节，特别是激 活与细胞存活相关的信号通路【6】。抑制细胞凋亡、促进感染细胞短期存活以延长病毒复制时间，是 病毒急性感染中短期维 持细胞存活的主要机制，持续的凋亡抑制可引起慢性感染和潜伏感染171。真核细胞内有多条信u．转导 通路参与调节细胞生存与凋亡之间的平衡。磷脂酰肌醇二羟基激酶(P13K)在多条信号通路中发挥中 心作用，通过其下游效应分子调节细胞多种功能【8】。丝／苏氨酸蛋白激酶(nkt，PKB)是Pi3K的上要下 游效应分子之m[91。现已证实，P13K．Akt信号通路在细胞增殖、细胞周期调节、蛋白质合成、细胞存 活和凋亡等方面具有重要作用【l们。多种病毒在感染过程中都能调控宿主细胞P13K．Akt信号通路来完 成病毒的复制【II一引。目前人们对P13K．Akt信号通路在ALv-J复制中所起的作用尚不清楚。本研究选 导通路活化的关系。以期探讨外源性ALV的感染和复制机制。 2材料与方法 2．1病毒的细胞培养DF．1细胞株由扬州大学兽医学院秦爱建教授赠送。血管瘤病变型ALV．J毒株 农业大学动物科技学院崔治中教授馈赠。 接种物，并测定TCID50，剩余病毒保存于．70℃。 2．2P13K／Akt信号通路与病毒复制检测DF．1细胞接种入24：tL板，实验分组包括直接感染病毒组，用 组，一定时间后分别收集细胞和细胞一卜清，Westernblot分析Akt磷酸化水平，real．timePCR检测病毒 RNA合成水平，IFA检测细胞内病毒蛋白表达水平，ELISA检测细胞卜清病毒粒子含量。 2．3免疫间接荧光检测0FA)DF．1细胞消化至细胞培养板中，按照2．1方法接种病毒，收毒后，用PBS 洗涤细胞，用4％多聚甲醛同定15min。加A,1：200稀释的抗ALV．J gp85单克隆抗体(Eh扬州大学兽医 中衫会桥)，37℃孵育lh。PBST洗涤后，在荧光显微镜下观察、拍照。 2．4病毒滴度测定利用半定量方法对ALV．J进行定量。将病毒用维持液作连续lO倍稀释(10之～lO‘8)， 27l g二*±目禽#分干±*#术青}学者*k论i辈 接种已长满单偿DF．1细胞的96孔培养扳．每个稀释度接利,84L，同时设2列不接种病毒的卒白对照。37 2．5病毒RNA台成水平检测将细胞消化培养至细胞培养板中．按照1l方法接种病毒．每纽重复3孔， 培养一定时间后，弃去上清，ⅢPBS洗涤细胞后 反转录产物用于real．timePCR检测病毒RNA合成 M·MLV反转录试剂盘(Takara)说明书进{亍反转录 7500RealTime SYBROreen 水’y-。real—timeFCR利用ABI 2．6蛋山质印逋沾(Western 含量。取15ug蛋口样品按照常规方法进{T10％SDS和Westemblot分析。一抗为兔抗}Akt(Santa Cruz)，GADPHIJ内参对照，抗为抗兔IRDye 像系统仪器(LI—c0RBiosciences)进行荧光显色莆啪照。 2 I 1 7统训分析采用SPSS5软件分析数据，训量资料以均数±标准差(x±s)表示，统计方法采用T检 验{击．以P005作为检验标准。 3结果与分析 3l ALV-J感染激活DF一1细胞中的P13K—Akt信号通路 体进行Westemblot，分折发现各ALV毒株感染DF-I细胞均导致细胞中磷酸化Aid水平在15