定点突变巴曲酶在毕赤酵母中de克隆与表达.pdfVIP

蛇 志 JournalofSNAKE(Science8LNAtureareKEytohealth) 2011年第 23卷第 2期 Vo1．23No．2，2011 定点突变 巴曲酶在毕赤酵母 中的克隆与表达 王宏英，徐 梅，兰海英，杨 宇，张宏杰，李 娜，薛 雁 ，薛百忠 (辽宁诺康生物制药有限责任公司，辽宁沈阳 110071) [摘要] 目的 为避免毕赤酵母分泌的Kex2蛋 白酶对发酵液中所表达的巴曲酶的降解。利用重叠 PCR方 法对 巴曲酶基 因进行定点突变 ，将 巴曲酶基因第 45位的Arg突变为 Lys。 方法 将突变后 的基 因克隆到 酵母分泌型表达载体 pPICZ~A 中，将重组载体酶切线性化后经电转化转入 巴斯德毕赤酵母细胞，筛选鉴定转 化子 ，经摇瓶发酵 甲醇诱导 ，酵母菌分泌表达有凝血活性的定点突变 巴曲酶，经 SDS-PAG 电泳、免疫 印迹确 定其分子量为 32kD。 结果 发酵罐的表达量达到 52KU／ml发酵液，较重组天然巴曲酶的表达量提高了 73．3 。 结论 定点突变巴曲酶的表达量 比重组天然 巴曲酶的表达量有显著提高，表达的突变巴曲酶同样 具有凝血活性 。 [关键词] 突变巴曲酶；类凝血酶；巴斯德毕赤酵母；克隆和表达；偏好密码子；套叠 PCR [中图分类号] Q78；R977．3 [文献标识码] A [文章编号] 1001—5639(2011)02—0105—06 doi：10．3969／j．issn．1001—5639．2011．02．004 CloningandExpression ofmutantBatroxobin，aThrombin—like Ennzzyymmee，，i’nPiiCchIIiapaassttoorriissbbyyOvveerrllaappExtensionPCR WANG Hong—ying，XU Mei，LAN Hai—ying，YANGYu，ZHANGHong-jie， LINa，XUE Yan，XUE Bai—zhong (LiaoningNuokangBio—pharmaceuticalCo．，LTD，Shenyang，Liaoning，110071，China) Abstract： Objective Inordertoavoidsecretedbatroxobinexpressedinp．pichiaX一33being hydrolysisbyKex2protease，thegeneofbatroxobin，athrombin-likeenzymeofbathropsat— roxmoojenivenom，wassite—directedmutatedbyoverlapextensionofPCR．Thearginineresi— duesatpositions45oftheprotein productarereplacedbybasicamino acidresiduesLys， whichisKex2proteasesite． M ethods Themutantgeneofbatroxobinwasclonedintoex— pressionvectorpPICZaA andtransfered intoPichiapastorisX一33．Therecombinantmutant batroxobinwasseparatedandpurifiedfrom fermentation liquid，showingimmunologicaland enzymeactivitybywestern—blottinganalysisand fibrinogen—clottingassayrespectively．The molecularweightisabout32．0kD by SDSanalysis． Results Theproduction of mutantrecombinantbatroxobincouldachieve52KU／mlfermentationliquidebyfermentor。 theyieldriseb