CTLA4-Ig的表达、修饰与肿瘤免疫治疗策略性的分析.pdfVIP

射 黼 本研究主要进行了以下两个方面的实验工作： (1)CTLA4Ig融合蛋白在 细胞中豹稳定表达。 一、CTLA4Ig融合蛋白在CHO—dhfr细胞中的稳定表达 在T淋巴细胞的激活过程中是一条重要的共刺激途径。B7与T细胞表面的配体 CD28结合后，能够为T细胞的活化提供共刺激信号，激活T细胞产生免疫应 答。两CTLA*4的作用与CD28正好相反，它传递的是阴德第二信号，调节T 纲胞活化。虽然T细腿表面的cTLA．4表达非常少，毽CTLA一4与B7分子的亲 和力明屈高于CD28数十倍，因此，CTLA-4具有优先结合B7分子的特性。 裘和力明显高于CD28。由予其为一段蛋鑫分子，与细胞表藉的B7分子结合后 不产生生物效应，可以起到封闭作用。利用多种方法研究表明，CTLA4．k融合 蛋白，可以作为一种新型的免疫抑制剂，对临床移植排斥反应有明显的抑制作 用。 本实验塞曾从MT2细胞系克隆获得了CTLA4全长基因，由186个氨基酸 组成(胞外功能段含有124个氨基酸，穿膜区含有26个氨基酸，胞内功能医含 寄36个氨蓥酸)，并将其臆外段与人璁GFc进{亍了融合，得到了具鸯功能酌 CTLA4．Ig融合分子。研究结果表明，所得到的CTLA4．Ig融合蛋白，具有预期 的生物学功能，能够抑制淋巴细胞的转化，弗证实cTLA4．Ig影响T细胞的活 化是通过多种途径实现豹，冀枫制之一是撩涮核内结合于IL．2增强子RE／Ap位 点的核因子的活化。 在实验室上述已有工作藻础上，本研究将CTLA4．Ig克隆到具有二氢叶酸 还原酶(d播)筛选标记基茵的真核表运载体pCl．d11爵中，首先在COS7细胞 中进行了瞬时表达，证明我们所构建的真核表达载体能够在真核细胞中表达出 目的融合蛋白。接着我们将禽有cTLA4．Ig融合分子的真核表达载体转染到二 M 氢时酸还原酶(dll妊)缺陷毪细胞(cHO—dh抒)，糟104MTX加压焉，进行 党隆化簿选，挑出表达星较离的宠隆避行扩大培养，培养上涛中驰CTLA4．19 融合蛋白表达产量达到10ug／ml，可用ProteinA桂进行纯化。细胞株连续培养 三个月，上清中蛋自的分泌量没有发生明显变化，初步证明得到的细胞株比较 稳定。本实验得到的细胞株和纯化的蛋是，为进～步磷究奠定了綦破。 (2)GPI—cTLA4Ig嵌台分子的构建和在cH0一dhfr-细胞中的稳定表达 现在瓣硬变认为，瓣诀阕释异体移攘捺斥反应魄缀娃途径是诱导移植受体 产生针对移植抗原的特异链免疫辩受，僵至今在该领域尚未肖突破性进展。本 研究提出了诱导供者特弗性免疫抑制及耐受的新设想和新机制。基本思路是： 罔基因遂组的方法，将cTLA4-Ig与介导袋蛋白的翻译后糖目旨修饰的信号肽部 分融合，表达于适当的宿主细胞，表达后形成GPI修怖的嵌合蛋白(GPI— CTLA4Ig)，嵌合器白经缝化屠用予处理移植物细胞，一方颡逶过封闭移檀物细 胞上的B7分子而逃避受体宿主的免疫抑制；另一方面，由于移植物中的T细 胞表露通过GPI嵌合了一定数量的CTLA4Ig两优先与密主缎胞上的B7分子结 合，阻颧了宿主抗原对移攮物中T缨胞的激活，从两W有效抑制移植物抗宿主 反应。 本磅究奁已获得CTLA4基联的基否出上，用基嚣重组豹方法，将从衰变期 嵌合分子。将嵌食分子究隆到具有二氢叶酸还原酶筛选标记基因的真核表达载 体pcI．dh心中，在二氢叶陵还原酶缺陷的cHO细胞中获得了稳定表达，经细胞 免疫荧光检测证实，表达的GPI．CTLA4Ig嵌合分予，主要整合在细胞膜上，两 分泌型的￡T乙醚艳刘主要表达在缨胞浆中，拐步说瞒GpI偿母胶起翻了应有豹 作用。 本磷究将嵌台性GPI，C甩A4Ig章每建到食二氢咔酸还原薅(强蠹)鲍囊核袭 这载体pcI．魏盘蘑，转染dh矗缺陷的cH0细胞系，熠MTX加压筛选后，用细 胞免疫荧光染色的方法发现，有的缨胞膜上融合蛋囱的表达燕很离。经过适当 豹克隆筛选，有可能获得离表达的缎臆株。我们将细臆大量扩增培养，从5×l妒 细胞中，可大约得到lmg的GPI锚定蛋自。我们下一步的工作，将要探索合 遥的蛋鲁质纯亿相重新整食豹条停，建立GPI一锚定蛋蠡转移方法，为基予￡潆{ 锚定蛋自转移技术的移植免疫耐受和肿瘤疫苗等方谱的研究打下基础。 2 [第一部分] CTLA4Ig融合蛋白在GHO—dhfr一细胞中的稳定表达