慢病毒载体介导HIF-1α基因修饰骨髓间质干细胞促进脑缺血大鼠神经功能恢复实验研究.pdfVIP

慢病毒载体介导HIF．1a基因修饰骨髓间质干细胞促进脑缺血大鼠神经功能恢复的实验研究 慢病毒载体介导HIF．1a基因修饰骨髓问质干细胞促 进脑缺血大鼠神经功能恢复的实验研究 申请人姓名：叶伟标 指导老师：邓宇斌教授 专业名称：病理学与病理生理学 摘要 脑缺血损伤是最常见的中枢神经系统疾病之一。既往对脑缺血损伤的治疗主 要通过超早期溶栓或微创介入恢复血供，挽救脑缺血半暗带的部分神经元。但是 缺血中心区神经元的死亡仍难以避免，而且因溶栓治疗时间窗过短限制，仅有较 少患者能接受该种治疗。也正因为脑缺血后，缺血中心区神经元死亡的不可逆性， 脑缺血性疾病治疗的关键在于挽救缺血半暗带濒临死亡的神经元和促进损伤后 神经功能恢复。大量实验研究表明，经静脉移植的骨髓间质干细胞(bone marrow-derivedstem mescnchymal cells，BMSCs)能够穿越血脑屏障到达缺血损伤 区，通过细胞替代或分泌神经营养因子参与缺血脑损伤神经功能的修复。BMSCs 具有分离方便、增殖容易、免疫原性较低、易于基因操作的特点。因此，BMSCs 不仅本身可参与缺血脑损伤神经功能的修复，同时还可作为脑缺血基因治疗的载体。 factor-1，I-IIF-1)是细胞在缺氧条件下 缺氧诱导因子一l(Hypoxia．inducible 产生的具有转录活性的核蛋白。HIF．1由ⅢF．1a和HIF．1p两个亚基组成。HIF—lp 为基础表达蛋白，而HIF．1a为氧依赖调节蛋白。HIF一1的表达主要取决于HIF．1a 的生成和降解。脑缺血发生时，缺血局部HIF．1作为低氧反应的一种核转录调节 因子被上调，通过对其下游靶基因(VEGF、EPO、CXCR4等)的诱导表达，调 控无氧代谢、血管生成、细胞增殖迁移分化等，在脑缺血损伤后的神经功能修复 中起重要的作用。 因此，我们设想通过慢病毒载体介导HIF—la基因修饰BMSCs移植治疗脑缺 血，以求基因和细胞治疗相互结合，从而促进脑缺血后神经功能恢复。 实验分为以下两个部分： 一T一 慢病毒载体介导HIF．1a基因修饰骨髓间质干细胞促进脑缺血大鼠神经功能恢复的实验研究 第一部分：HIF．1a慢病毒载体的构建、鉴定 实验目的： 利用定点突变技术对HIF．1a进行定点突变获得常氧下稳定表达的HIF．1a突 变体，构建携带HIF．1a基因的重组慢病毒，为下一步感染靶细胞并在体内外获得 长期、稳定的表达打下基础。 实验方法： I和BamH l酶切 变，获得pCDNA3．I—HIF．1a-P402A-P564G-N803A质粒，经Kpn 定向克隆至pENTR／D-TOPO中，构建成Gateway入门载体 pENTR-HIF-l LR重组反应将 a—P402A-P564G-N803A—EGFP。应用Gateway 变型HIF．1 a慢病毒载体pLenti6／V5．HIF．1 毒载体与慢病毒包装系统共转染293FT细胞，收获并纯化病毒液。 实验结果： 经过各个步骤的鉴定，成功构建了携带HIF．1a基因的重组慢病毒，病毒滴度 TU／ml。 为3．36x108 第二部分：HIF．1a修饰骨髓间质干细胞促进脑缺血大鼠神 经功能恢复的研究 实验目的： 探讨HIF。la修饰骨髓问质干细胞移植对脑缺血大鼠神经功能恢复的影响及 其可能的作用机制。 实验方法： 利用第一部分成功收获并纯化的病毒液感染BMSCs，获得稳定转染HIF．1a 慢病毒载体介导HIF．1a基因修饰骨髓问质干细胞促进脑缺血大鼠神经功能恢复的实验研究 的BMSCs后，通过RT-PCR和