甘草愈伤组织遗转化体系建立与盐胁迫差减cDNA文库构建.pdfVIP

ClassifiedIndex: CODE:10075 U.D.C: NO A Dissertation for the Master’s Degree of Science Establishment of Genetic Transformation System and Construction of Subtractive cDNA Library under NaCl Stress of Cultured Cells of Glycyrrhiza inflata Candidate: Chen Zilong Supervisor: Prof. Liang Yuling Academic Degree Applied for: Master of Science Specialty: Botany University: Hebei University Date of Oral Examination: June, 2014 摘 要 摘 要 甘草是中药中最常用的药材之一。人工种植的甘草因诸多客观条件限制使得甘草所 含有的主要药用次生代谢产物含量很低，进而影响到甘草的药用价值。随着生物技术的 发展，通过生物工程技术来调控甘草次生代谢途径，从而提高其有效成分含量成为一种 有效的方法。 本实验室筛选的胀果甘草愈伤组织生长速度快，遗传稳定性强，甘草黄酮、甘草多 糖等次生代谢产物含量高，在振荡培养条件下可以形成稳定的悬浮培养细胞系，适合于 甘草次生代谢产物生物合成途径的相关研究。胀果甘草愈伤组织遗传转化体系及其盐胁 迫下差减文库的构建为获得目的基因和目的基因导入甘草细胞，以及甘草次生代谢途径 中生物合成相关基因的分离与鉴定和进一步利用基因工程手段调控甘草次生代谢产物 的生物合成研究奠定了基础。 本实验建立了农杆菌介导的甘草愈伤组织遗传转化体系。EHA105 和 LBA4404 两 种根癌农杆菌菌株都含有植物表达载体 pBI121-gfp ，该质粒上携带有新霉素磷酸转移酶 基因(NPTII)和绿色荧光蛋白基因（gfp ）。设置不同培养时间的愈伤组织作为受体材料和 农杆菌不同侵染时间两组条件，对胀果甘草愈伤组织进行遗传转化体系建立研究，并优 化了转化条件。最佳转化条件为：继代培养 7d 的愈伤组织作为受体材料，用含有 pBI121-gfp 植物表达载体的根癌农杆菌 EHA105 菌株侵染 15min，共培养 3d 后，Kan 100mg/L 筛选培养筛选 45d 获得转化的愈伤组织，转化率最高可达到 97.14% 。 本研究以胀果甘草愈伤组织为材料，通过抑制性消减杂交技术(SSH)，构建了其盐 胁迫下的正反向差减文库。比较以Primer 1 为引物的第一次PCR 及巢式引物第二次PCR 扩增结果，以及蓝白斑筛选出阳性克隆最终得到质量合格的差减文库。共获得 983 个 阳性克隆，文库重组率为 85.7% 。选取60 个阳性克隆测序，EST 序列分析结果显示： 可能具有功能的基因约为 75% 。这些基因与白云杉(mRNA)、大麦(韧皮部蛋白) 、玉米(泛 素)和小麦等高度同源，参与转录调控、蛋白质合成等多个生物学过程，表明甘草愈伤 组织盐抗性基因与数据库中的模