甘蓝SCR识别合SRK胞外域核心区的酵母双杂交检测及SCR相应编码区DNA序列的确定.pdfVIP

中文摘要 甘蓝SCR识别结合SRK胞外域核心区的酵母双杂交检测及 SCR相应编码区DNA序列的确定 生物化学与分子生物学专业硕士研究生薛丽琰 指导教师朱利泉教授 中文摘要 结球甘蓝(Brassicaoleracea L．)是白花菜目、十字花科、芸薹 Lvar．capitata oleracea 属植物，属于甘蓝(BrassicaL．)的一个变种，其种植栽培地区已遍及全 国各地，是我国主要的种植蔬菜之一。甘蓝属于雌雄同花植物，为了避免近交衰 退等白花传粉带来的不利影响，甘蓝进化出可以造成杂交优势明显的自交不亲和 现象，研究表明包括甘蓝在内的芸薹属植物的自交不亲和性是由具有复等位基因 的单一位点——S位点控制。其中自交不亲和反应的起始扳机反应是S位点富含半 胱氨酸蛋白(S．10cus kinase， cysteine．rich protein，SCR)与S位点受体激酶(S．receptor SRK)之间的相互作用，两者之间相互识别和结合核心区段的位置及氨基酸残基 组成尚不完全清楚，是目前的研究热点之一。本研究以结球甘蓝D3的花药cDNA 为初始模板，利用巢式RT-PCR、酵母双杂交技术深入研究了S位点受体激酶与S位 点富含半胱氨酸蛋白相互作用，主要研究内容和结果如下： 1、SCR基因的克隆及其生物信息学分析 A区设计引物，利用巢式PCR，以 通过SCR信号肽保守氨基酸和mRNA的ploy A区，编码58个氨基酸的SCR蛋白。在二级结 含一个开放阅读框、3-UTR区和ploy 构预测上，预测结果显示序列中包含a．螺旋和B．折叠结构。由系统进化树可知，S3 与$20的SCR亲缘关系较近，说明这两个单倍型的SCR在演化过程中分支时间较晚； 与$28的SCR亲缘关系较远，说明二者的SCR在进化上较早时间开始分支。 2、不同截短长度的S位点富含半胱氨酸蛋白(SCR)片段的克隆及其序列特征 本研究利用高度自交不亲和材料D3，提取其花药中RNA，获得DNA模板，然 后设计引物，通过PCR技术获得相应的目的片段。理论分析表明各个片段其大小是 292 bp，239bp，66bp，90bp，135bp，141bp，144bp，60bp，108bp， bp，256 78 bp、54bp、63bp和33 36、26、18、21和11个氨基酸残基。 两南大学硕十学何论文 3、母双杂交重组诱饵质粒的毒性及自激活检测 良好，并且菌斑大小无明显差异；此表明诱饵质粒pGBKT7SCRn表达对酵母细胞 显蓝色出现，说EI凋pGBKT7SCRn在酵母细胞中没有激活报告基因，无自激活现象 出现。 4、酵母双杂交法检测甘蓝SCR与SRK之间的相互作用 由酵母双杂交试验结果表明同时进行试验的14个实验组中，只有 ．ku／X．a．Gal／AbA平板上长出明显的蓝色茵落，说明激活了报告基因，证明酵母双 杂交系统可以用于SCR与SRK发生相互作用的识别位点位的证明，试验结果还表明 两者相互作用识别位点位于SCR的成熟肽序列开始至fJCys3之间，这从实验上首次 域有相互作用的DNA片段位于SCR的第97～186 bp处。由实验组pGADT7eSRK 菌落，但信号肽剪切位点及其邻近的几个氨基酸残基缺失的实验组 xpGBKT7SCRl3在平板上无 菌落长出的结果说明信号肽剪切位点及其邻近的几个氨基酸残基缺失的实验组 SCRl和SCRl3与eSRl沅相互作用。推测这可能与信号肽剪切位点及其邻近的几个 氨基酸残基与其编码的多肽会影响实验结果。 关键词：甘蓝；自交不亲和；S位点富含半胱氨酸蛋白(SCR)；酵母双杂交；蛋