石斑鱼虹彩病毒UTPase及两个囊膜蛋白的鉴定和功能初步分析.pdfVIP

石斑鱼虹彩病毒dUTPase及两个囊膜蛋白 的鉴定和功能初步分析 专 业：生物化学与分子生物学 博士生：公杰 指导教师：秦启伟 摘要 grouperiridovirus，SGIV)是从养殖的石 新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore 斑鱼中分离到的水产动物重要病毒病原。已经对病毒的理化性质，流行病学，全 基因组信息等进行了比较系统的研究。本文不仅建立了赤点石斑鱼的肾组织细胞 系，并在分子水平对SGIV编码的dUTPase及两个外膜蛋白进行鉴定和功能初步 分析，为研究病毒的致病机理提供技术平台和理论依据。主要结果描述如下： 1、采用组织消化法建立了赤点石斑鱼肾组织细胞系(EAGK)，通过显微 镜观察，细胞计数、染色体分型和细胞转染等分析了传代细胞系的特征。EAGK 细胞可以在含lO％FBS的L15培养基中保持良好的生长趋势，培养的适合温度 在25．30℃；染色体数目82条。细胞转染实验证明，CMV和SV40启动子可以 启动外源转染基因在细胞内的高效表达。此外，通过显微和超微观察、病毒滴度 测定等方法证实EAGK细胞对SGIV敏感。以上结果揭示新建的EAGK细胞不 仅能够用于体外遗传操作，而且可以用于水生动物病毒分离鉴定、病毒致病机理、 功能基因及病毒与宿主相互作用的研究。 2、通过同源性搜索和生物信息学分析表明：SGIVORF049R编码一个尿密 啶脱氧核糖核苷三磷酸酶(dUTPaSe)；在其氨基酸序列近C．端存在一段核输出 信号(nuclear export 感染过程中的作用，对SGIV编码的dUTPase基因进行了克隆、表达、转录时序 分析及亚细胞定位等特征分析。RT．PCR和WesternBlot的结果证实，该基因是 一个病毒早期转录本，属于立即早期基因。通过真核转染和荧光显微镜观察，显 示该酶是一个胞质型蛋白，分布在细胞核外的胞质区。同时，我们对NES片段 PCR缺失，发现NES缺失后，SGIVdUTPase无法正常输出细 进行Overlapping 胞核，证明NES序列对SGIVdUTP嬲e输出细胞核起决定性作用。这是首次在 dUTPase家族中发现NES介导的核输出转运机制，将对进一步了解病毒基因在 SGIV感染细胞中精细的亚细胞水平调控具有重要的指导意义。 3、病毒的外囊膜蛋白在病毒感染、复制及致病过程中起重要作用。参照 以往报道的分离囊膜蛋白的方法，我们改进了一种新的分离SGlV外囊膜的方 法。不仅可以方便快捷的分离病毒外囊膜和外膜蛋白，同时对病毒衣壳组分没 有明显破坏。利用这种方法，我们分离了SGIV的两个外囊膜蛋白：VPl9和 VP75。分别对两个基因进行克隆、表达和抗体制备后，通过免疫电镜技术证 实VPl9和VP75是病毒的外囊膜蛋白。药物抑制实验显示，AraC可以抑制 加工厂共定的位特征；VP75则分布在病毒加工厂外。抗体中和实验显示，VPl9 抗体对病毒入侵具有强烈的抑制作用，VP75抗体对病毒入侵有一定的抑制作 用，证明VPl9和VP75可能在病毒入侵阶段发挥重要作用。 本研究中新建的细胞系为分离鉴定水生动物病毒、细胞遗传、病毒功能基因 研究提供了材料。对病毒基因的鉴定及功能的分析也为进一步研究病毒感染复制 机理提供了重要的信息。 关键词： 新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGⅣ)，尿密啶脱氧核糖核苷三磷酸 酶，核输出信号，石斑鱼肾细胞系，病毒外囊膜分离，外囊膜蛋白 Il Identificationandfunctional of investigation dUTPaseandtwo encoded envelopeprotein by lridovirus(SL一／1V1 Sin2a[Groui