海洋微拟球藻mcroRNA测序鉴定及其转基因体系的建立.pdfVIP

海洋微拟球藻microRNA测序鉴定及其转基因体系建立 i croRNA测序鉴定及其转基因体系建立 海洋微拟球藻m 摘 要 翻译过程，参与基因的表达调控。它广泛存在于人、动物、植物和病毒中，与人 类疾病、动物生长发育、植物抗逆等过程密切相关。miRNA的研究目前在动植 物中较为深入，在单细胞微藻中研究相对较少，仅在莱茵衣藻(C办切砂如mD”∞ 脂含量达到干重的30％以上，可作为能源微藻良好的候选藻种。 本研究以海洋微拟球藻(人切挖以D幽肠加筇妇Dce日托fc口)为实验材料，通过SoleXa 高通量测序首次鉴定了该藻中的miRNA，并建立了该藻的遗传转化体系，旨在 海洋微拟球藻中实现利用人工设计的miRNA进行基因沉默奠定基础。本研究包 括如下二个部分： 第一部分，提取海洋微拟球藻的总砒蛆，分离其中小于200bp的小RNA， 高通量测序，获得了数百万条小I矾A序列，剔除tRNA、d矾A和可能的mIⅢA 将测得的序列分别与已经报道的和海洋微拟球藻基因组进行比对，发现有37条 序列与已经报道的其他物种的miRNA相似性较高，相似度均达90％以上；2条 序列与已知同源性较低，但是与已知的两条miRNA的前体序列几乎匹配，且与 该藻基因组能够完全匹配，而这2条序列在基因组的上下游序列可形成发夹结 miRNA的前体序列相似度很低，但与基因组的相应序列可完全匹配，推测这组 序列可能是海洋微拟球藻中特异性表达的miI矾A。进一步分析表明，测序获得 的miRNA的5’端具有对U碱基的偏好性，这一现象与已经报道的其他物种的 miRNA相似。 遗传转化体系建立是利用人工设计的miRNA进行基因沉默的平台和基础。 4 海洋微拟球藻microlⅢA测序鉴定及其转基因体系建立 本研究第二部分构建了海洋微拟球藻的转基因体系。以pMSl88和pCB801为基 础质粒，成功构建了同时含有抗性基因6彪和多克隆位点的新载体pCJ901，进一 步在多克隆位点中插入报告基因e卯P，获得用于转化的重组质粒pCJ90l—eGFP。 通过电击转化的方法，将重组质粒pCJ901．eGFP转入海洋微拟球藻，成功实现 抗性基因和报告基因的表达，说明海洋微拟球藻转基因体系构建成功。 本研究通过Solexa高通量测序首次鉴定了海洋微拟球藻中的miRNA，并通 过电击转化法建立了该藻的遗传转化体系，为在海洋微拟球藻中实现利用人工设 计的miRNA进行基因沉默奠定了基础。 关键词：海洋微拟球藻；micr0RNA；转基因体系；e@P 5 海洋微拟球藻microRNA测序鉴定及其转基因体系建立 Smal I RNAHi f i onofMi croRNAs l denti i cat by gh r i th ng oughputSequenc ofa i n andestabl i shmenttrangenesystem i s Oceani ca NannOch|OrOpS ABSTRACT micro剐NAs甜e the INA，wim1eng也of～22nt， endogenoussin西e-s