《吡虫啉的酶联免疫吸附分析方法研究 An Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Detection of Imidacloprid》.pdfVIP

第38卷 分析化学 FENXIHUAXUE 研究报告 第12期 of 1737—1741 ChineseJournal 2010年12月 AnalyticalChemistry 1301：10．3724／SP．J．1096．2010．01737 吡虫啉的酶联免疫吸附分析方法研究 彭方毅1 姜海蓉州 陈远翔1 陈胜珍1 林治华1 廖璞砣 何苗3 施汉昌3 蔡强4 1 重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆400050 2 重庆市临床检验中心，重庆400014 3 清华大学环境模拟与污染控制国家重点联合实验室，北京lOOOS4 4 浙江清华长三角研究院生态环境研究所，嘉兴314001 摘要通过碳二亚胺法将吡虫啉交联于牛血清蛋白 BSA 作为免疫抗原，混合酸酐法将吡虫啉交联于卵清 蛋白 OVA 作为包被抗原，免疫Balb／e小鼠，采用B细胞杂交瘤技术，经免疫、融合、筛选、克隆，得到抗吡虫 7，确定了毗虫啉酶联免疫吸附分析方法 啉单克隆抗体，抗体亚类为lgGl，制备的单克隆抗体效价达l×10 叫L，检出限为 1．76±0．02 斗g／L。与其它吡虫啉结构类似物无交叉反应。批内相对标准偏差为4．5％； 批间相对标准偏差5．1％，饮用水、重庆理工大学地下水和重庆市花溪河地表水平均添加回收率分别为 102％。97％和85％。本研究建立了一种快速检测环境水中吡虫啉残留的方法。 关键词吡虫啉；半抗原；酶联免疫分析法；单克隆抗体 1 引 言 吡虫啉 IMI ，属中等毒性，通过阻断神经受体并且导致害虫麻痹最终死亡。在哺乳动物体内有蓄 积作用…，对人体外周血淋巴细胞遗传物质易造成损害¨J。由于吡虫啉已广泛应用于农业生产，进入 水环境的途径日益增多，环境样品中发现吡虫琳残留的情况也日趋严重。因此，建立一种测定这类化合 物的简单、快速、有效的方法非常必要。目前，这类化合物的检测方法多以高效液相色谱法 HPLC 为 主【3，4J，但需精密仪器，费时长，不适合大批量样品的快速测定。免疫分析方法尤其是酶免疫分析方法， 因其成本低、速度快、灵敏度高、仪器设备简单，适合大批量样品的快速分析，可为吡虫啉残留的检测和 监控提供了极大的便利条件【5．6】。吡虫啉的免疫分析技术多采用多克隆抗体，未见吡虫啉单克隆抗体 的相关报道[7-lo]。本研究采用本实验室制备的吡虫啉特异性单克隆抗体，建立了定量测定吡虫啉的间 接竞争ELISA方法，快速准确地分析检测吡虫琳在样本中的残留量。本方法灵敏度高特异性强，样品 前处理简单，便于进行现场监控，可以与常规方法互为补充。 2 实验部分 2．1仪器与试剂 计 日本岛津公司 。ProteinA亲和层析柱 Amersham Beckmancoulter公司 。 6—8周龄雌性Balb／c小鼠 每只约18～20 g，重庆医科大学实验动物中心 ；吡虫啉完全抗原 本 研究室制备 ；小鼠SP2／0骨髓瘤细胞 本研究室保存 ；95％吡虫啉原药 重庆农药化工 集团 有限公 鼎国生物技术有限公司 ；酶联免疫吸附测定 ELISA 中所用的试剂均为国产分析纯试剂，按照文 2010-02-10收稿；2010-06—10接受 E·mail：r0102@163．eom；liaopu@sina．tom 万方数据 1738 分析化学 第38卷 Gibco ，羊抗小鼠lsGHRP酶标二抗 华美生物工程公司 。 2．2实验方法 2．2．1吡虫啉免疫原与包被原的制备与鉴定采用碳二亚胺法¨21将半抗原吡虫啉与BSA偶联制备免 mol／L 疫抗原；采用混合酸酐法¨列将吡虫啉与OVA偶联制备包被抗原。反应液在0．01 PBS pH7．2 中4℃透析，去除游离小分子化合物，偶联物分装后于一20℃保存。根据半抗原、载体蛋白质和偶联物 的紫外扫描图谱鉴定半抗原是否与载体蛋白质有效偶联，根据三者在选定波长 280llm 的摩尔吸光系 数 占 估算半抗原与载体蛋白质的结合比：R 占偶联物一占载体蛋白 店半抗原。 2．2．2抗体制备用免疫原皮下多点免疫Balb／c小鼠，每只100恤g。每隔3周进行1次加强免疫。 每次免疫1周后取小鼠尾静脉血用ELISA方法检测抗体效价，当抗体效价达到104—10j时开始融合。 融合前3天尾静脉加强免疫。第3天进行细胞融合。免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞 Sp2／O 以10：1混 择性培养基内，分种于加有昆明小鼠腹腔渗出细胞作滋养层的96孔细胞培养板中，37℃下置于5％ CO：培养箱中培养，生长达1／3—1／4视野时，取上清液筛选。融合后第6～8d，融合细胞开始形成集 落，计算细胞融合率，并进行全换液，3—5d后进行第一次ELISA筛选。以筛选到仅与吡虫啉-OVA阳 性反应，与BSA、OVA不反应的孑L进行亚克隆。一