ige核酸适体物传感器的研究.pdf

摘要 随着分子生物学和基冈I。科领域的迅速发展，研究的不断深入，人人推动了对核酸的研 究，人们对核酸的研究已经相当深入。利_}{=J寡核苷酸间的严格的识别和亲和力而设计的人l： 合成寡核营酸一适体(aptamer)的出现，使抗体抗原反虑发生新的革命性变化，弥补了现有 抗体的不足。也为传统免疫传感器发展开辟了一条新的道路。电化学阻抗适体阵列传感器就 是一种全新的思路和尝试，与传统的监测技术相比，传感器具有快速、灵敏、操作简单，并 具有分子识别功能。为此本实验以人免疫球蛋向E(IgE)及其DNA核酸适体为模型体系，在 电极表面通电与不通电的方式将巯基修饰的适体【制定在光刻金阵列电极表面。通过电化学阻 抗检测技术测定了适体修饰电极与人IgE二者相互作用后阻抗值的变化关系。为今后高通餐 阵列核酸适体传感器的定向、快速阉定探索一条新的途径。 1．无标记电化学阵列传感器 电极基底为ii英，面积为36mm×26mm。采¨{照相平板印刷的方法通过蒸镀使其沉积在涂 有50埃厚的铬的表面，沉积厚度为200纳米每个|‘作电极人小为2mm×2mm。孵育电极面积 为5mm×5mm。在每次向定生物分子之前，芯片浸入浓piranha酸溶液中30分钟使其除去 氧化层．使用前清洗干净。 将禽有24孔的聚二甲基硅氧烷(PDMS)覆盖在芯片表面，24个】．作电极从24个孔中露 u 出。在24个金电极上每个加入15l适体溶液。放在湿盒内过夜使适体同定在芯片表面。适 体I矧定，|亓，每个电极刚TE缓冲液冲洗，水洗，氮气吹干，_L|；』丁电化学测量。 通过条件优化实验，加入、r胱胺小分子浓度在0．1mmol／L，适体分子的Ⅻ定时间为90分钟 蛋白在芯片表面孵育时间达到90分钟，可取得最佳实验效果。人IgE的浓度检测限在 0．inmol／L(5fmol在50uL样品内)．每个浓度实验重复4次，在浓度范同5．O-i00nmol／L 芯片表面阻抗变化具有良好的重复性，平均相对标准偏若为7．4％。 71 特异性实验中修饰适体斤芯片阻抗值为452±152Q，作川非特异性蛋白人IgG后阻抗 值为532±66 55Q．著异显著。 48Q，而作州特异性蛋白人IgE后阻抗值为978±152 与IgE抗体免疫传感器的灵敏性进行了比较，金电极表面首先修饰了抗人IgE抗体。IgE 孵育到IgE抗体修饰的芯片表面l小时斤，和背景相比检测信号增加42．4％。而IgE适体修饰 nmol／L 的芯片表面当孵育50 IgEl小时，雨『背景相比检测信号增加216．4％，结果筹异显著。 和单链核酸适体传感器相比，杂交斤彳舣链适体闻定在芯片表面阻抗值546+_99．15Q，作 用人I酊及IgE后阻抗值分别为756±75．37Q，816±5941Q，作川蛋白后阻抗变化不明显， 著异不显著。 特异性实验结果由原子力显微镜进行了验证，显微镜幽象与芯片阻抗变化结果吻合． 2．电寻址适体阵列传感器 通过条件优化实验，周定适体的电压范同在一0．2v—o6v，通电时间5分钟，扫描速率 50mv／s时，适体【嗣定效果最佳。 我们选择四种结构相似，序列组成不同的适体问定到电极芯片表面，米验证电极芯片与 生物分子作崩的通Ⅲ性及比较不同结构适体与Igg蚩向作川的亲和力强弱。同定适体厉电极 V 为1890±467Q，1433±115Q，1450±507Q．1450±259Q。 研究了适体上发卡环结构的不同对适体与人IgE相互作用的影响。将适体序列I及序列 V固定到芯片电极表面，并检测了其同定及作用人IgE后阻抗值，发现适体发膏环碱基结构对 适体与人IgE蛋白作用影响显著。 特异性实验结果由原子力显微镜进行了验证，显微镜图象与芯片阻抗变化结果吻合． 结论： 1．我们研制了适体基础的电化学阻抗传感器。和传统的免疫传感器相比适体基础的传感 器在传感性 能上显示出更大的优势。 2适体的同定是适体生物传感器制备中极其重要的一步。通过以上实验，我们取得了电 寻址嘲定方法的最佳条什，为微阵列生物传感器的制备提供了