pcv2b-1、pcv2b-1b、pcv2b-1c安徽分离株免疫原性比较研究.pdf

Anhui Agricultural University Dissertation for the Masterate The Comparative Research of Immunogenicity for PCV2b-1A, PCV2b-1B and PCV2b-1C Strain From Anhui Candidate: Wang Yan Supervisor: Prof. Li Yu Academic Degree applied for: Master of Agriculture Speciality: Preventive Veterinary Medicine Research field: Infectious diseases of domestic animals College: Animal Science and Technology College June, 2013 摘要 猪圆环病毒2 型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是引起仔猪断奶后多系统衰竭综 合征(PMWS)的主要病原，分为PCV2a 、PCV2b 和PCV2c 三种基因亚型。我国优势 流行株为PCV2b ，目前安徽地区PCV2 分离株也均属于PCV2b ，分属于PCV2b-1A 、 PCV2b-1B 和PCV2b-1C 三个不同基因簇，研究发现，PCV2b-1A 和PCV2b-1B 的氨 基酸序列总体上较为一致，但PCV2b-1C 的氨基酸序列与PCV2b-1A 、PCV2b-1B 相 比变化较为明显，发生改变的位点主要集中在ORF2 的两个免疫反应区。为探讨同一 基因亚型不同基因簇的PCV2 安徽株免疫原性是否存在差异，本实验通过以下工作内 容展开研究，为PCV2 疫苗的研究与选择、PCV2 的致病机理与防控措施提供理论依 据。 选择同一基因亚型不同基因簇的3 株PCV2 安徽株(PCV2-DY0801 为PCV2b-1A ， PCV2-BH0801 为PCV2b-1B ，PCV2- XC0801 为PCV2b-1C)感染小鼠，通过ELISA 方法和流式细胞术检测感染小鼠血液中IgG 水平、T 细胞亚群数量和Th1/Th2 细胞因 子含量的变化。参照GenBank 登陆的PCV2 ORF2 基因的特异性引物，采用PCR 扩 增ORF2 基因，克隆到pET-32 α表达载体，构建重组质粒pET-32 α-ORF2，并转化 至大肠杆菌Rosetta (DE3) 中诱导表达3 株PCV2 ORF2 编码的Cap 蛋白，通过免疫印 迹试验鉴定重组蛋白的免疫活性，纯化的重组蛋白加弗氏佐剂，乳化后用于免疫小鼠， 检测免疫后小鼠抗体IgG 水平和Th1/Th2 细胞因子含量的变化，从而观察3 株PCV2 安徽株免疫原性的差异。 结果显示：3 株PCV2 安徽株感染小鼠后均产生较高水平的IgG，其中BH0801 + + 组在第21d IgG 水平显著高于XC0801 组(P＜0.05) ；3 组感染组外周血中CD4 、CD8 + + 和CD4 CD8 细胞数量与对照组相比均明显减少，其中BH0801 组在感染后第14d + + CD4 数量显著低于XC0801 组(P＜0.05)，但感染后期CD4 数量又高于XC0801 组。3 组感染组血清中IL-4 和IL-10 含量显著升高，与对照组相比差异显著(P＜0.05) ；同时 IFN- γ水平从感染后第7d 时升高，第21d 和28d 时下降并显著低于对照组(P＜0.05) 。 其中BH0801 组小鼠血清中IL-2 含量在第14d 显著高于XC0801 组，第21d 显著高于 DY0801 组和XC0801 组