猪繁殖障碍性疫流行毒株的分离、鉴定及其多重pcr诊断方法的建立.pdf

猪繁殖障碍性疫病流行毒株的分离、鉴定及其多重PCR诊断 方法的建立 摘 要 猪繁殖障碍性疫病是近年来养猪生产实践中最为普遍和突出的问题，已给我国养 猪业带来了巨大的危害和损失。其中猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、圆环 病毒和伪狂犬病毒等在临床上多引起猪的繁殖障碍性疫病，且常呈混合或继发感染。 本研究采集临床疑似猪繁殖障碍性疫病病料，在初步分析和鉴别诊断的基础上，对繁 殖障碍性疫病流行病毒株的分离和鉴定，克隆并分析其重要功能基因，为研制新型疫 苗奠定基础；并建立适于临床应用的快速诊断方法，为猪病防控提供有效的技术手段。 主要研究如下： 1、采集江西省某猪场疑似猪繁殖障碍性疫病病料，经RT-PCR检测为猪繁殖与 6代时出现明显的细胞病变，RT-PCR检测为阳性，继续传代增殖，扩增、克隆和分 析其基因代表序列，测定病毒感染细胞和靶动物的能力，电镜观察病毒粒子形态。结 的临床症状和病理变化；电镜观察可见约20nm的典型的PRRS病毒粒子，表明已成 扩增法，从分离株中分别扩增PRRSV 白氨基酸序列分析发现，该毒株与国内近年来分离的高致病性PRRSV毒株的同源性 基酸，这表明该毒株为变异的美洲型PRRSV毒株。结构蛋白基因遗传演化关系分析 进一步证实该毒株的变异存在某种地域上的相关性，但每个基因的变异，并不严格遵 从地域上的相关性。 2、采集甘肃兰州某猪场疑似猪瘟病料，处理后接种PK．15细胞盲传，经RT-PCR 检测为猪瘟病毒(CFSV)E2基因阳性，继续传代增殖，测定病毒感染细胞和动物的 能力，电镜观察病毒粒子形态。电镜观察可见约25rim的典型的CSF病毒粒子。细胞 毒接种于家兔无体温变化，接种30日龄仔猪可复制到猪瘟典型的临床症状和病理变 化，证实已分离到猪瘟强野毒株CSFVGSLZ株。已CSFVGSLZ株分离毒为材料， 外分离株同源性比较，发现与其有较高的同源性。与中国C株的氨基酸序列及其抗 原表位比较，发现在主要抗原区发生了变异。 3、利用PCR技术从断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)疑似病料中，扩增、克 隆和分析了两株PCV2全基因组，全长均为1767bp，同源性和结构特性分析显示两 种毒株的变异主要发生在ORF2区段，ORFl区段相对较保守。遗传演化关系分析显 示，本试验克隆的2株PCV2皆属于欧洲型毒株，2株病毒全基因组序列同源性为 95．8％，分别命名为PCV2 的分子流行病学调查以及预防控制提供了理论依据。 份I临床样品检测，证明该方法具有很好的特异性、敏感性和重复性，这为上述几种繁 殖障碍性疫病的早期诊断和鉴别诊断提供了一种快速、敏感、特异的诊断方法，也为 其病原的分离、分子流行病学调查以及免疫预防控制提供了理论依据。 关键词：繁殖障碍；流行毒株；分离；鉴定；功能基因克隆；序列分析；多重PCR 技术 lI ofvirusesDiseaseswith Isolation，identification porcine disturbanceestablishmentofamulti-PCR reproductive metllo{1 di：lZ ,,thoddiagnosis Summary Diseases、^，itll disturbancebecamemoreandmore inrecent reproductive popular havebeen onthe of inChina，and years，which harminggreatly developmentpigindustry causedoneormore swinefever and by