猪细小病毒vp蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心elisa方法的初步建立.pdfVIP

摘 要 摘 要 以纯化的重组细小病毒的 VP2 蛋白免疫BALB/c 小鼠，通过细胞融合技术，间接ELISA 筛选和3 次以上细胞克隆，获得了5 株稳定分泌抗PPV VP2 蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株， 分别命名为2D5 、1F11、2B4 、3C8、1H3。5 株杂交瘤细胞染色体平均数均为88±10 对，分 泌抗体亚类4 株为IgM 类，分别是1F11、2B4 、3C8、1H3；1 株杂交瘤细胞2D5 为IgG2a ， 5 株杂交瘤细胞2D5 、1F11、2B4 、3C8、1H3 制备的细胞上清抗体ELISA 效价分别为1: 5000、 6 5 4 4 4 1: 2000、1: 1000、1: 800、1: 800，腹水抗体效价分别为1: 10 、1: 10 、1: 10 、1: 10 、1: 10 。 Western blot 检测表明5 株单抗均识别猪细小病毒VP2 蛋白；间接免疫荧光鉴定表明5 株单抗均与PPV 全病毒发生反应；而不与TEGV、PRV 和PEDV 反应，与猪细小病毒具有较 强的特异性反应。并且5 株杂交瘤细胞在体外连续传代3 个月和冻存后再复苏均不能影响抗 体分泌的稳定性。实验结果均表明，所制备的PPV VP2 蛋白单克隆抗体对病原检测具有很高 的特异性，PPV VP2 单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立为PPV 病原基础性研究和以此抗体建立 病原特异性免疫学检测方法奠定了重要的物质基础。 为建立细小病毒双抗体夹心ELISA 方法，制备了兔源抗猪细小病毒血清抗体。主要制备 -4.6 过程是用ST 细胞繁殖细小病毒（PPV ），经测定该病毒的TCID50 为10 ，0.1mL ，该病毒经 高速离心和蔗糖密度梯度离心纯化后免疫家兔。对制备的单克隆抗体和多克隆抗体利用辛酸- 饱和硫酸铵法和亲和层析柱联合法进行了抗体的纯化，纯化后的多抗浓度为 4.9mg/mL ，经 SDS电泳分析 IgG 重链和轻链区带明显，纯度为 100% 。纯化后的单抗浓度为 0.23mg/mL ，经SDS电泳分析IgG 重链和轻链区带明显，纯度为100%。 以纯化的多抗和单克隆抗体为基本检测试剂，进行了双抗体夹心ELISA 方法检测病毒的 探索，通过将纯化后的多抗和单抗经方阵法确定单抗最佳工作浓度为4.6µg/mL （1: 50），兔 抗PPV 多抗的为6.1µg/mL （1: 800），建立的方法其最低检出量为155 个TCID50 ，比血凝试 验敏感度高32 倍。该检测方法与TEGV、PRV 和PEDV 无交叉反应，多次重复性试验稳定 性较好。双夹心 ELISA 的建立不但为生产上提供了一种更简单、快速、灵敏及应用广泛的 PPV 检测方法，而且为进一步建立更快、更直观、更简便的检测方法提供了依据。 关键词 猪细小病病毒；VP2 蛋白；间接ELISA ；单克隆抗体；双抗体夹心ELISA I Abstract Preparation of Monoclonal Antibodies against VP2 Protein of PPV and Preliminary Establishment of Double-Antibody Sandwich Elisa Abstract The purified recombinant VP2 protein of PPV(Porcine parvovirus) was used to immunize BALB/c mice, and the McAbs(monoclonal antibodie