透明质酸发酵法备及其复合改性研究.pdf

摘要 摘 要 Y1829655 透明质酸(hyaluroIlicacid，简称HA)是一种重要的医药材料和化妆品原料，并被列 为新资源食品。近年来，微生物发酵法已经逐步取代了动物组织提取法，成为制备HA 的主要方法。 在发酵法制备HA的过程中，需要对大量发酵液样品进行HA含量的测定。传统的 Bitter．Miur法测定步骤繁琐，以浓硫酸．咔唑溶液为反应试剂，具有一定危险性。本研究 考察了十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylall】monium 产生混浊的特性，建立了CTAB比浊法：配制25 min， 为CTAB比浊法的吸收波长，在室温下，将纯化后的样液与CTAB试液准确反应10 各样品的测定时间误差控制在10s以内，通过标准曲线测算出待测样中HA含量。试验 表明，CTAB比浊法的准确度、精确度和灵敏度均高于Bi地r_Muir法。除了蛋白质外， 其它杂质对C即圆比浊法影响较小。该法安全性高，操作简便快捷，适合对大量发酵液 ooODa。 样品进行测定，适用于测定HA的分子量范围为≥50 辐照相结合的方法对出发菌株进行诱变选育，筛选出无溶血性、HA产量和分子量均较 000 高的突变株NCl68，其HA产量为150．61m∥L，分子量为677Da。突变株经过多 次传代，HA产量和HA分子量保持稳定，溶血性无回复突变现象，为进一步研究发酵 法生产HA打下了基础。 针对突变株NCl68，通过单因素试验和二次正交旋转回归试验对其发酵培养基进行 了优化，并建立了回归模型： 由此得到了最佳培养基：酵母膏30 1．5 g／L，蛋白胨20g／L，葡萄糖5g／L和MgS04·7H20 g／L，模型预测HA产量为174．76mg／L，验证试验HA产量达到178．53m∥L，模型能较 好的预测HA产量。将此培养基应用于5 L发酵罐，进行分批发酵试验。研究表明：pH 值，初糖浓度，温度和搅拌速度对HA产量均有显著影响。优化的培养条件为：pH值 r／min。5 为7．O，初糖浓度为30g／L，温度35℃，搅拌转速200 L发酵罐分批发酵HA 的产量可达3．O 模型对菌体生长过程中生物量和HA产量进行非线性拟合，结果表明，生物量模型以 2．849 Logistic模型拟合效果最佳，拟合方程为：y=2．933— 相关系数R2 达到0．999；而在HA合成拟合中，以Slogistic模型最佳，拟合方程为：y= 再7面面：丽可’ 26．566 为：为： y=2．085+ 相关系数R2为0．991。 y=Z．U芍，+ 摘要 采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀与超滤相结合的方法对HA进行分离纯化。 将发酵液稀释到HA含量为0．6．0．8 g／L，加入发酵液体积15％的CTAB溶液(质量分数为 10％)，在35℃下沉淀1h，将沉淀置于浓度为1．5mo儿的NaCl溶液中解离4h，选择 浓度为70％乙醇进行沉淀。经上述处理后HA得率可达93．8％，HA中蛋白含量可降至 1．5％。选择截留分子量为100KDa的超滤膜对经过季铵盐沉淀得到的HA进行超滤， 样液浓度为0．02％．O．05％，过膜压力为1lpsi，HA得率可达到93．5％，蛋白去除率达到 酸含量可达43．5％，达到医药级水平。