蜕皮激素诱导的腺相关基因表达研究.pdf

蜕皮激素诱导的丝腺相关基因表达研究 中文摘要 蜕皮激素诱导的丝腺相关基因表达研究 中文摘要 在实时荧光定量PCR 中一般采用各种不同的管家基因作为内源参照基因对目的 基因进行校正，以消除不同样本在RNA 产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差 别。理想的内参基因应在各种实验因素条件下，各种类型的组织或细胞中均恒定表达。 然而，大量的研究结果表明，内参基因的表达并不稳定，如果没有合适的标准化处理， 盲目地使用某一管家基因作为内参，可能导致错误甚至相反的结论。 本文按照MIQE 规则检测了家蚕7 种常用内参基因(Actin 3、GAPDH、28SrRNA 、 RPL3 、α-Tubulin、UBC 和 TBP) 正常条件下的不同发育时期及蜕皮激素诱导条件下 在不同组织的转录表达水平, 并利用标准化分析软件geNorm 和NormFinder 进行稳定 性分析，找到了不同实验条件下在不同组织中相对稳定表达的基因。利用筛选出的内 参基因检测了Fib-H ，Fib-L ，Fmbp-1 和SGF-1 基因在家蚕后部丝腺，P25 ，Ser-1，SGF-1 和Fmbp-1 基因在中部丝腺，Fib-H ，Fib-L ，SGF-1 和Fmbp-1 基因在脂肪体组织中的 转录水平变化，通过比较组织间的转录水平，分析蚕体组织以及Fib-H 、Fib-L 、P25 、 Ser-1、SGF-1、Fmbp-1 基因在蜕皮激素诱导后的表达调控特征。研究结果如下： 1.正常条件下内参基因的稳定性 采用RT-PCR 检测了7 种内参基因在家蚕五龄第一天至第七天的表达水平，然后 使用内参基因稳定性分析软件geNorm 和NormFinder 对内参基因的稳定性进行评估。 软件分析结果显示在不同组织中相对稳定的基因是不同的，其中α-Tubulin、GAPDH 在中部丝腺，GAPDH、UBC 在后部丝腺，α-Tubulin、UBC 在脂肪体组织中表达相对 较为稳定。 2.蜕皮激素诱导刺激条件下内参基因的稳定性 使用geNorm 和NormFinder 软件分别对候选的7 种内参基因在20E 诱导条件下 五龄第2 天0 至72 h 的表达水平进行评估。其中内参基因α-Tubulin、28SrRNA 在中 部丝腺，GAPDH 和28SrRNA 在后部丝腺，α-Tubulin 和UBC 在脂肪体中的表达相对 稳定。 I 中文摘要 蜕皮激素诱导的丝腺相关基因表达研究 3.蜕皮激素诱导后Fib-H 、Fib-L 、P25 、Ser-1、SGF-1 和 Fmbp-1 基因的组织转录水 平分析 蜕皮激素诱导后Fib-H ，Fib-L ，P25 ，Ser-1 基因在后部丝腺、中部丝腺中的表达 量都有不同程度的降低，表明家蚕五龄幼虫早期阶段外源添食蜕皮激素对于Fib-H ， Fib-L ，P25 和Ser-1 基因表达有一定抑制作用。SGF-1 和Fmbp-1 基因在蜕皮激素诱导 后在后部丝腺、中部丝腺中的表达量分别在不同的时间点出现了升高，表明蜕皮激素 可以促进SGF-1 和Fmbp -1 基因的表达。丝蛋白基因的表达有众多的调控因子，关于 表达调控的复杂网络还有待于进一步研究。 本研究按照 MIQE 规则对家蚕常用的七种内参基因在正常条件下的不同发育时 期及蜕皮激素诱导条件下在不同组织中的稳定性进行分析，研究发现，在不同实验条 件下，不同组织中最稳定的内参基因是不同的。在实时荧光定量PCR 实验中，内参 基因的选择是很重要的，要根据具体的实验进行选择，盲目地使用某个基因作为内参 基因目的基因的表达将会被误导，为研究家蚕功能基因组织转录水平的定量分析法提 供一定的指导意义。 关键词：实时荧光定量PCR ；MIQE ；内参基因；标准化；家蚕 作 者：吴 玉 指导老师：沈卫德