鱼过敏原的肠道控释放及诱发免疫耐受的机制.pdf

谨以此论文献给尊敬的林洪教授及我挚爱的家人与 朋友。 孙 妙 鱼过敏原的肠道可控释放及诱发免疫耐受的机制 摘 要 鱼类作为受人欢迎的食物，营养丰富、味道鲜美，但鱼肉中存在的过敏原使 许多消费者望而却步，严重影响消费群体的扩大化。目前针对食物过敏的处理方 法主要有两种，消除食物中过敏原的活性或治疗食物过敏产生的症状。但这两种 方法治标不治本，过敏患者不能从根本上摆脱食物过敏的困扰，只能食用经特定 处理的食物或随时治疗过敏症状。立足以上问题，本研究旨在制备一种安全有效 的，能够使机体对过敏原产生免疫耐受的食物，令过敏患者从根本上摆脱无法食 用过敏食物的困扰。 本论文以鱼类过敏原为对象，以海藻酸钠为包埋基质，制备两种具有缓释作 用的可食用微球，经优化、表征、体外释放选择出一种微球应用至过敏机体使之 产生口服免疫耐受，最后探讨其产生耐受的机制。主要内容如下： 1. 提取纯化鱼类主要过敏原——小清蛋白。以大菱鲆为原料，采用盐析、 凝胶层析等方法对小清蛋白进行纯化，获得分子量为 12 kDa 的电泳纯小清蛋白， 得率为 0.286 %，经免疫印迹检测显示其具有免疫活性。 2. 比较两种缓释微球的包埋及体外释放行为，获得适用于小鼠口服免疫耐受 试验的材料。首先采用滴注法制备出海藻酸钠-小清蛋白微球，达到最佳包埋率 的制备条件为：3 % 海藻酸钠溶液滴入 pH 为 1.0 的 5 % CaCl2 溶液。FTIR 、DSC 及 SEM 等的结果显示微球表面粗糙，并分布有大量的微小孔洞，小清蛋白成功 包埋入微球。体外释放试验显示其体外释放率最大可达 61 %，释放动力学符合 Higuchi 模型、Ritger-Peppas 模型，释放机制为骨架溶蚀蛋白扩散。采用乳化法 制备出海藻酸钠-小清蛋白微球，得到小清蛋白的包埋率 （83.79 %）较滴注法包 埋率提高，粒径降低，释放率可达 73 %，释放动力学符合零级释放动力学模型， 释放机制为线性扩散。比较而言，乳化法得到的海藻酸钠-小清蛋白微球粒径小、 包埋率高、释放效率高且缓释时间长，此种微球适宜作为口服免疫耐受的原料。 3. 证实缓释微球激发过敏原口服免疫耐受的有效性，探究其免疫耐受机制。 相较于过敏模型组，口服微球耐受的小鼠机体特异性 IgE 抗体的产生量减少 25.85 % ，总 IgE 抗体减少 36.61 %，血清 IL-4 减少 27.75 %，说明机体产生了免 疫耐受效果。从剂量角度来讲，低剂量口服过敏原的效果更佳；从蛋白状态来讲， 经微球包埋的过敏蛋白与溶解状态的蛋白溶液均可激发免疫耐受反应，且蛋白经 微球的包埋与缓释作用后，耐受过程的安全性有所提高。分析耐受的机制，口服 低剂量鱼类过敏原促进机体产生IgG 抗体，使机体特异性IgE 抗体的产生量减少， 并促使机体免疫系统 Th2 细胞向 Th1 细胞转化，恢复 Th1、Th2 细胞间的平衡； 口服高剂量过敏原仅促使机体免疫系统Th2 细胞向 Th1 细胞的转化。 本研究通过建立两种鱼类过敏原可控释放微球的制作方法，分别研究了其结 构特征，对体外释放曲线及释放机制进行了探讨，证实了其激发口服免疫耐受的 效果，初步阐明了其诱导机体产生免疫耐受的机制，为开发过敏原免疫耐受食品 提供了技术基础。 关键词：大菱鲆；过敏原；缓释微球；免疫耐受；机制 Intestinal Tract Controlled Release of Fish Allergen and the Mechanism of Inducing Immune Tolerance Abstract As the popular food, fish is eutrophy and delicious, but fish allergen makes many consumers shrink back at the sight of fish, so allergen have a strong impact on the amplification of cusumers. At present