lox-1体外究模型的建立及其功能检测.pdf

摘要 论文摘要 动脉粥样硬化(AS)是威胁人类健康的常见心脑血管系统的疾病，常累及大中 型血管，以血管内皮细胞内和细胞间大量脂质堆积、单核／巨噬细胞浸润、泡沫 细胞形成、血管平滑肌增殖等为特征。在AS发生发展过程中，氧化型低密度脂 蛋白(ox．LDL)通过细胞表面清道夫受体(SR)被细胞摄取，使其形成泡沫细 胞。泡沫细胞大量沉积在血管壁是AS发生的标志。SR在摄取脂质时不受胞内 脂质代谢负反馈调节，可使细胞无限制的摄取OX．LDL，使其在细胞内不断堆积， 导致细胞破裂形成血管壁脂质斑块。同时，血管内皮细胞也通过SR摄取OX．LDL， 除引起内皮细胞脂质堆积外，还引发一系列内皮细胞功能紊乱，这更加剧了AS 的进展。LOX．1是一种新型的清道夫受体，最早发现于牛血管内皮细胞表面， 随后研究发现巨噬细胞，平滑肌细胞上也有表达。LOX．1在结构上与已知的SR 家族其他成员不同，在功能上有所较大差异。巨噬细胞上的LOX．1能增加细胞 对脂质的摄取，参与泡沫细胞的形成；俪表达于内皮细胞表面的LOX．1与OX-LDL 结合后可活化OX．LDL／LOX．1系统，从而引起内皮细胞的一系列功能改变，引起 血管平滑肌细胞增殖，逐步向内膜迁移，加剧管腔狭窄，促进AS的进展。目前 研究已证实LOX．1作为SR家族的一员，在脂质结合与代谢中有重要作用，但 是，对于LOX．1在众多致AS因素中的关键作用尚不十分清楚，尤其阻断LOX．1 功能后细胞功能变化的报道亦不多见。本实验室曾对SR家族众多成员在泡沫细 胞形成过程中的功能进行过系统研究，本课题在前期实验的基础上，进一步探讨 了LOX．1与OX．LDL特异性结合能力以及阻断LOX．1后相应细胞功能的变化， 明确了LOX．1在脂质代谢中的重要作用，为进一步探讨LOX．1与脂质结合的关 键位点提供了有效的研究手段。 本课题利用佛波醇酯(PMA)诱导人单核细胞株THP．1形成巨噬细胞，并 从该细胞中获得cDNA文库，采用分子克隆方法得到LOX．1基因片段，利用 EGFP．C1质粒作为克隆载体，通过脂质体转染法使低表达SR的293T细胞过表 摘要 达LOX-l，并能与OX．LDL特异性结合。再采用RNAi技术对该受体沉默后观察 细胞与OX．LDL结合变化，设计了针对LOX．1的3个SiRNA干扰片段，并利用 pSilencel．0质粒作为载体，构建了3个干扰质粒。用脂质体转染法分别将它们转 SiRNA】。 本研究成功的建立起了过表达LOX．1的293T细胞模型，研究结果显示：在 原本低表达SR的293T细胞中成功转染LOX．1后，细胞与脂质结合能力明显增 AATGAGAAATCCAAA 强(增加了6．3倍)。同时，构建并筛选出了以CTG GA为靶序列的短发夹RNA重组质粒，该质粒可特异性的沉默LOX．1基因的表 达，mRNA水平沉默效率80％，蛋白水平沉默效率达86％，LOX．1基因沉默以 后与过表达LOX．1的293T细胞相比，结合OX．LDL的能力下降73％。以上结果 显示LOX．1在脂质结合方面有重要作用，同时本课题中所构建的质粒及细胞模 型为以后进一步研究LOX．1功能提供了有效的研究工具。 RNAi 关键词：LOX．1，动脉粥样硬化，清道夫受体，OX．LDL， II Abstract ABSTRACT acomlTloncardiovasculardiseasethatthreatenshuman Atherosclerosis(AS)is health．Itofteninvolvesandmedium—sizedvessels．ThefeaturesofASarethe large of amountof ofmononuclear large lipi