蓝光诱导猪视网色素上皮细胞复制衰老的实验研究.pdf

夫律医科土学硕士毕主论文 蓝光诱导猪视网膜色素上皮细胞复制衰老的实验研究 中文摘要 目的： maeular 年龄相关性黄斑变性(age-related 岁以上老年入低视力和盲的首要原因，细胞学和病理学研究提示AMD玻璃膜 疣表面的视网膜色素上皮(retinal pigmentepithelium，RPE)细胞可以发生类似 细胞复制衰老的改变。本研究目的在于观察蓝光对猪RPE细胞复制衰老过程中 衰老相关-B-半乳糖苷酶(湖esccnce 的影响，为探讨蓝光损伤和复制衰老(replicative 胞生物学相关机制方面提供理论根据。 方法： 1．采用胰蛋白酶消化法培养猪原代RPE细胞，观察细胞的生长状况及特性， 免疫组化及免疫荧光鉴定细胞来源。 2．细胞培养融合后，传代于50ml培养瓶，第3代后将各组细胞培养瓶置于 自制蓝光发光二极管(1ightemitang 全包裹培养瓶。 3．将各组细胞的第3代到第6代，消化后调整细胞密度为2X105个／ml，接 种于24孔板培养24小时，加入4％多聚甲醛固定后进行SA．t3．Gal活性的检测。 高倍镜下观察是否有蓝色颗粒的阳性表达，随机选取5个视野计数100个细胞中 阳性细胞数目，每组实验重复3次。 4．将各组细胞的第3代到第6代，消化后调整细胞密度为1×104b／mi， tetrazolium 2。5．diphenyl bromide，MTT)法检测细胞增殖情况。每组做6个复孔， ．I． 天辟正科土学硕士丰生论文 重复3次。 5．采用SPSS 12．0统计软件，所有数据用均数±标准差(i±s)表示，经 正态性检验和方差齐性检验，方差齐后进行多因素方差分析，并用LSD-t检验 对各组均数之间两两比较。P≤O．05具有统计学意义。 结果： 1． 体外培养的猪原代RPE细胞生长良好，有的呈集落式生长，细胞呈不 规则形，接近融合时近六边形，传代稳定，细胞复苏效果良好，免疫组化及免疫 荧光鉴定抗角蛋白抗原阳性。 2． 不同光照强度的蓝光作用于第3代到第6代猪RPE细胞，随着光照强 度增加，细胞内出现蓝色颗粒的阳性细胞数目逐渐增多，SA．B．Gal活性增高， 不同光照强度之间F=144．81，P0．01，除高强度与中强度光照组相比差别没有 统计学意义(PO．05)外，其余每两组之间的差异均具有统计学意义(P．0．05)； 随着传代次数增加，细胞内出现蓝色颗粒的阳性细胞数目逐渐增多，SA-B．Gal 活性增高，传代次数之间F=23．41，P0．01，在不同的传代次数之间，除第4代 和第5代之间差异没有统计学意义(跏．05)外，其余每两组之间的差异均具有 统计学意义(pO．05)。 3． 通过MTT法检测，细胞的增殖能力随传代次数增加而降低，不同传代 细胞的增殖能力随光照强度增加而降低，不同光照强度之间F=86．52，P0．01， 除中强度与低强度光照组相比差别没有统计学意义(尸O．05)外，其余每两组之 间的差异均具有统计学意义(Po．05)。 结论： 本研究成功的培养了猪原代RPE细胞，细胞保持正常增殖能力，免疫组化 及免疫荧光鉴定抗角蛋白抗原阳性，所采用方法与人RPE细胞培养相近，来源 广泛，取材不受限制，操作更方便，可以在某些方面代替人RPE细胞来进行实 验方面的研究工作；应用自制的蓝光发生装置，观察了蓝光对猪RPE细胞复制 衰老后sA-B—Gal阳性率的影响，证实了蓝光可以诱导体外培养猪RPE细胞复 ．H． 炙薛医科土学硕士毕主论文 制衰老，并且传代次数增加可以促进细胞复制衰老；率先将蓝光、RPE细胞复制 衰老和AMD三者结合起来，对于蓝光诱导的RPE细胞复制衰老的机制研究提供 理论支持，对于阐释复制衰老在AM