诱导小鼠胚胎干胞分化为小肠上皮样细胞及小肠内定植的研究.pdfVIP

9湖嘲■—● 诱导E14小鼠胚胎干细胞分化为小肠上皮样细胞及小肠内定植的实验研究 摘要 诱导E14小鼠胚胎干细胞分化为小肠上皮样 细胞及小肠内定植的实验研究 中山大学附属第二医院消化内科 硕士研究生：邰艳红 导师：陈其奎教授 摘 要 小肠上皮细胞是哺乳动物消化吸收的主要细胞，由于各种原因(放射损伤、化疗等) 引起的小肠上皮细胞形态改变和功能受损，可导致严重的消化不良；小肠切除后引起 的短肠综合征及Crohn’s病等炎症性肠病所致的小肠顽固性溃疡严重的威胁着人类的健 康，使患者的生存质量显著下降，是临床上面临的一个棘手的问题。以往的治疗方法 包括胃肠外营养、应用生长激素和小肠移植等均有一定的疗效，但由于费用较高，病 人的生活质量低下，小肠移植存在的供体缺乏、免疫排斥等问题限制了其应用。长期 以来人们一直在探索能否有一个新的途径彻底解决这类疾病。 胚胎干细胞(embryonic ICM)分离出来的一种多能细胞系，是一群未分化的细胞，可以在体外长期不断增殖， 自我更新，并保持多向分化潜能，可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型的 细胞，甚至构建各种组织、器官。只要能找到一种使胚胎干细胞向着预想的方向进行 定向分化的方法，我们就可以得到用于构建组织工程器官的种子细胞，甚至直接移植 到体内对疾病实施治疗，这为我们提供了一个全新的手段。现在已经有实验研究证实 胚胎干细胞可以在体外被定向诱导分化为神经细胞、心肌细胞、造血细胞、肝脏细胞、 胰岛细胞、软骨细胞等多种细胞，但是体外诱导胚胎干细胞向小肠上皮细胞的定向分 化国内外均未见报道。 本研究分三个部分，在第一部分中采用中性蛋白酶I和胶原酶Ⅺ消化19d胎鼠的 9冁掰_ 摘要 诱导E14小鼠胚胎干细胞分化为小肠一I-皮样细胞及小肠内定植的实验研究 小肠组织获得小肠上皮细胞，以作为本课题的阳性对照细胞；同时，通过胰酶的差异 消化方法获得了13．5d胎鼠的小肠间质细胞，并对其进行了长期培养，获得培养上清液 作为ESC的诱导液用于后续研究。第二部分着重对体外诱导小鼠ESC向小肠上皮样细 胞定向分化进行了观察研究。在特定的体外环境下ESC可以分化为多种细胞，而在整 个分化过程中细胞所处的微环境起着决定性的作用，因此用小肠间质细胞的上清收集 液模拟小肠上皮细胞发育的微环境，同时探讨人工诱导的分化条件，对不同浓度梯度 Factor，EGF)和肝细胞生长因 和不同的时间加入表皮细胞生长因子(EpidermalGrowth factor，HGF)的诱导效果进行了观察，并对分化后的细胞进行 子(hepatocytegrowth 了检测。在实验的第三部分中，首先通过x射线照射制作了小肠损伤小鼠的模型，并 分化后的ESC，并通过尾静脉注射入小鼠体内，观察其定植情况。 研究目的： 本研究以多向分化潜能为基础，体外诱导ESC分化为小肠上皮样细胞，分析小肠 间质细胞上清液和细胞因子EGF、HGF对诱导ESC向小肠上皮样细胞分化的作用，从 而探索更优化的分化诱导体系，为构建组织工程器官提供种子细胞；观察诱导后的ESC 在小鼠小肠内定植的情况，为其下一步体内移植治疗奠定实验基础。 研究内容及实验方法： 1． 原代培养：分别取19d和13．5d的胎鼠的小肠上皮细胞和小肠间质细胞进行体外原 代培养，小肠上皮细胞进行细胞形态学观察，AKP染色，行RT-PCR对乳糖酶．根皮苷． mRNA的表达水平进行检测，并作为实验阳性对照；小肠间质细胞进行免疫荧光染色 检测Vimentin蛋白的表达，并收集间质细胞培养上清液作为诱导液。 2．小鼠胚胎成纤维细胞(mouse 的孕鼠剖宫取出胚胎，用眼科剪剪碎胚胎，将组织块剪成约1mn3大小的碎块。在培养 离心后的细胞，悬于15ml培养基，约3d后细胞长满，传代，冻存，备用。 Ⅱ 9嘲稿一 诱导E14小鼠胚胎于细胞分化为小肠上皮样细胞及小肠内定植的实验研究 摘要 3． 体外培养、扩增ESC，采用悬滴培养法制备拟胚体(embr