巴西橡胶树棒孢霉落叶病病菌蛋白激酶基因突变体br ⊿iCCK1i的互补载体构建及转化.pdfVIP

江苏农业科学　２０１５年第４３卷第４期 — ２７— 曹申文，蒲金基，张　欣，等．巴西橡胶树棒孢霉落叶病病菌蛋白激酶基因突变体 ＣＣＫ１的互补载体构建及转化［Ｊ］．江苏农业科学，２０１５，４３（４）：２７－３０． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１５．０４．００９ 巴西橡胶树棒孢霉落叶病病菌蛋白激酶基因突变体 ＣＣＫ１的互补载体构建及转化 １ ２ ２ ２ １ １ 曹申文 ，蒲金基 ，张　欣 ，漆艳香 ，韦运谢 ，刘晓妹 （１．海南大学环境与植物保护学院／海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室，海南海口５７０２２８； ２．中国热带农业科学院环境与植物保护研究所／农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室，海南海口５７１１０１） 　　摘要：为了明确蛋白激酶ＣＣＫ１在巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌中的致病相关功能，在前期研究基础上通过ＰＣＲ扩 增，获得了该基因１６０４ｂｐ的５′端片段（Ｌ－Ｃ５）和１３１ｂｐ的３′端片段（Ｌ－Ｃ３），同时以ｐＣＡＭＢＩＡ３３００质粒为模板扩 增获得了５５２ｂｐ抗性标记基因（Ｌ－Ｂａｒ），并用Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ将Ｌ－Ｂａｒ基因反向插入了Ｌ－Ｃ５和Ｌ－Ｃ３  序列之间，克隆至ｐＵＣ１９载体上，成功构建了 ＣＣＫ１突变体的互补载体ｐ ＣＣＫ１－Ｃ。再从该载体上扩增互补片 段，借助ＰＥＧ介导法转化 ＣＣＫ１突变体的原生质体，经Ｂａｓｔａ平板筛选、ＰＣＲ检测和测序鉴定表明，获得了 ＣＣＫ１ 突变体的互补转化子。为进一步明确ＣＣＫ１基因在巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌中的致病相关功能打下了材料基础。 　　关键词：多主棒孢菌；蛋白激酶基因ＣＣＫ１； ＣＣＫ１突变体；互补载体；互补转化子 　　中图分类号：Ｓ４３５　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１５）０４－００２７－０３ 　　由多主棒孢菌［Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａｃａｓｓｉｉｃｏｌａ（Ｂｅｒｔ．＆Ｃｕｒｔ．）Ｗｅｉ］ 供试菌株和质粒：巴西橡胶树棒孢霉落叶病病菌 ＣＣ００４ 引起的巴西橡胶树棒孢霉落叶病是巴西橡胶树的重要病害之 菌株和含Ｂａｒ基因的质粒ｐＣＡＭＢＩＡ３３００，均由中国热带农业 一，现已在世界天然橡胶生产国普遍分布，该病害常造成橡胶 科学院环境与植物保护研究所提供。ＣＣＫ１基因突变体 树周年反复落叶，植株生长迟缓，枝条回枯或整株死亡，一般 ＣＣＫ１由笔者所在课题组提供。 ［１－２］ 胶乳减产２０％～４５％ 。目前，国内外对该病害的研究在 供试试剂：ＦｕｎｇａｌｇＤＮＡＫｉｔ和ＭｉｎｉＰｌａｓｍｉｄＫｉｔ为ＢｉｏＭｉｇａ 病害诊断、病原菌生物学、病害流行学和防治技术等方面取得 公司产品；Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ为 Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司产  了较大进展［３－７］，但在分子生物学研究方面仅报道了４个致 品；Ｐｅａｓｙ－Ｔ１和大肠感受态大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ５α ［８］ ［９］ ［１０］ ［１１］ 病相关基因ＣＣＫ１ 、ＣＭＰ１ 、ＣＣＨｏｇ１ 、ｃａｓ ，且大多处 为ＴｒａｎｓＧｅｎＢｉｏｔｅｃｈ公司产品；２×（ＨＳ）Ｔａｑ－ＭｉｘｔｕｒｅＫｉｔ和 于序列特征分析阶段。其中，ＣＣＫ１是本实验室从巴西橡胶 ＴＩＡＮｇｅｌＭｉｄｉＰｕｒｉｆｉｃ