亚低温对大鼠全缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡的干预作用.pdf

中文摘要 亚低温对大鼠全脑缺血再灌注损伤后 神经细胞凋亡的干预作用 摘 要 目的：近年来，随着临床急救水平的提高，一些心肺复 苏、心肌梗塞、休克、窒息等危重病人存活率逐渐提高，这 些疾病所造成的全脑缺血损伤以及缺血后再灌注损伤已成 为研究热点。其中，脑缺血及再灌注后如何减少神经元死亡 一直是临床研究的难点。 许多学者经过一系列脑缺血动物模型研究，从形态学、 生化等多角度证实凋亡存在于脑缺血再灌注损伤中。探讨如 何有效抑制凋亡是减轻脑缺血再灌注损伤的一个重要环节。 目前，脑保护剂虽然应用多年，但至今仍没有一种药物 能通过Ⅲ期临床的研究。而亚低温保护技术在各种解决方 案中具有自己的特色和优势。亚低温作为一种非药物性脑保 护疗法，与药物治疗比较具有一定的优越性，它可以干预脑 缺血再灌注的多个病理环节，对脑缺血及再灌注损伤起到保 护作用。本研究通过观察亚低温对脑缺血及缺血再灌注损伤 后细胞凋亡及Bel-2、Bax表达的影响，旨在为临床应用提供 可靠的实验依据。 亚低温按应用时机可分为缺血后即刻亚低温和再灌注 后不同时间点亚低温，本实验对亚低温作用的不同时间窗进 行凋亡百分率及Bel-2、Bax表达测定，在国内进行较少，为 前沿性的研究，具有一定的理论指导价值。 方法：l动物与分组：成年健康清洁级WiStar大鼠42 中文摘要 只，雄性，体重250．2809。随机分为3组，即假手术组(S．6 温组根据全脑缺血后给予亚低温的时间点不同又分为5组， 即缺血后即刻给予亚低温组(M1)；缺血再灌注后0小时组 每组均为6只大鼠。2模型制作：采用大鼠四条血管阻断方 动脉，次日夹闭两侧颈总动脉15分钟，恢复再灌注。对照 组和亚低温组均采用四血管阻塞法制备大鼠全脑缺血再灌 注损伤模型。假手术组仅切开颈部皮肤和肌层暴露双侧椎动 脉和颈动脉，但不阻断血管。假手术组和对照组置于室温下。 并维持大鼠肛温在(37±0．5)℃。亚低温组于缺血后的不同 时闻点给予亚低温。3标本制作：于再灌注及假手术组术后 头取脑，分离海马组织置于70％酒精中40C保存待检。4流 式细胞分析仪检测：①将固定或新鲜的组织放在120目不锈 钢网上置一平皿，用眼科剪刀将组织剪碎，用眼科镊子轻轻 搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗，直至将组织搓完为止。 将平皿中的混悬液用300目铜网过滤去除细胞团块，收集细 胞悬液，以500--800转／分钟，离心沉淀2分钟；②细胞 内参标准，与样品同步染色，加入碘化丙啶(PI) (PI：50Mg／L,triton-x1001．O％)1ML，在4C冰箱染色30分钟， 以500目铜网过滤，使样品成为合格单细胞悬液，即可上机 检测；⑨细胞的免疫荧光标记：取单细胞悬液l×10％,m， 中文摘要 加入鼠抗人单克隆抗体工作液0．1ML，室温孵育30分钟， 机检测；④采用美国BeCkMan Ⅱ型流式细胞仪，激发光源为15MW氩离子激光器，激发波 32 长为488nM，应用ExPoADC进行免疫荧光数据分析，用 AV分析软件对DNA细胞周期拟和分析。5统计 MutiCyCle 学分析：数据均以(均数±标准差)(；士S)表示。采用 SPSSl4．0统计软件单因素方差分析比较组间差别，两两比较 时首先检验方差齐性。方差齐时运用LSD-t检验，方差不齐 时用DurmettS’SC法进行统计学分析。P0．05为有统计学意 义。 结果：l凋亡百分率：各组经方差分析检验，F值为 细胞凋亡百分率为(2．3l±0．43)，明显小于其余各组；C组 各亚组比较，细胞凋亡百分率分别为M1组(8．74±O．51)， 比较，P值为0．363，大于0．05，差异不显著。其余各组两两 比较，P值均小于0．05，差异显著。 值远小于0．01，表明各组及亚组间差异显著。S组增殖指数 中文摘要 差异；其余各组两两比较，P值均小于O．05，差异显著。 3Bcl-2、Bax蛋白的表达 ． 3．1 值为远小于0．0