某些营养因素对髓间质干细胞体外分离纯化、定向诱导及移植治疗的影响研究.pdf

四川大学博士研究生论文 某些营养因素对骨髓闻质于细胞体外分离纯化、 定向诱导及移植治疗的影响研究 营养与食品卫生学专业 指导教师；王瑞淑教授张成教授刘玉清教授 博士研究生： 唐云安 中文摘要 干细胞研究在近几年来已经成为全球生命科学研究领域的一大热点，由于 成淬子缁照研究没有蕊精于绣稳研究掰褥舔的伦理之争及萁谴诸多难题丽疆益 受到关波，而其中的骨髓间质干细胞研究最多。研究证实，骨髓间质干细胞 stem ceils，BMSC)豫参与擒戚逡矗徽环境静还菇有多 (bonemesenchymat 向分化的潜能，在一定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、 蕊两缍魏帮神经绣瑰等。由予BMSC吴有来源方便、扩蹭逐速、可羹瞧强、 离成熟细胞近和县有多向分化潜能，而融可以实现个体化治疗，无免疫排斥问 题窝蹙溪之争等，困藏避最具寄滚庆应蠲饶势静耱子i鬟貔，在餐伤修复、缓织 威器官羹建、退行性疾瘸、遗传性疾病、抗肿瘤、抗衰老等方面具有广阔的应 灞魏曩。 本课题从静养因素角度对大鼠骨髓间质干细胞(r／3MSC)的体外分离、 缝亿、扩增、定囱诱导分伲及移攘治疗等俸嗣终一探索，鼓絮为接送BMSC磅 究与实际应用提供进一步的实验证据。本课题分三个部分进行，各部分的研究 嚣兹、实验方法、实验绫采蠢终论攮要分述絮下： (1)研究rBMSC的体外分离、纯化及扩增，并探索不同基础营养条件 貔影豌，谯纯肇葵条{牛。采嚣璺鑫壁法进行rBMSC夔分离墙蓁，并透避不龌售 鞠川大学博士研究生论文 代进专亍其缝纯帮扩增培养。簿溺一动物来源的鸯髓单缁脆悫液戮裙嗣鹣细照密 度分别接种于a—MEM、L—DMEM、H-DMEM、RPMI 1640四种不同类型的完 全培养液，荠遴行传代壤养，躐察细藏豹菇壁、蹭殪鞠缝纯籍况。荠程P1、羚、 P10、P15代测定克隆形成能力和细胞生长曲线。将传至第4代的rBMSC以 七种不同浓度曲L清的a—MEM和L—DMEM培养液内培养4d后，进行细胞计数， 毙较瑟秘壤券液不嗣浓度盘渍下缨熬熬生长、罐殖溃况。取传至繁4代豹 志懿鉴定。结桊显示，在本实验条{孛下露跌毒效分离缝讫rBMSC，逶避黉找扩 增培养可在体外获得大数量高纯度的rBMSC。不同培养液对rBMSC贴壁、增 建帮筑证具寿不同款影嚷：RPMI1640馥H。DMEM不逶宣于rBMSC豹俸蛰培 养，d．MEM培养液有利于rBMSC原代分离和初期纯化培养，L．DMEM有利于 其犷增墙蓁，簇嚣秘壤葵渡先爨结合缓援对rBMSC懿分褰缝纯露扩增效果畿 优。培养液中不同浓度的胎牛斑清对rBMSC的生长也有较大影响：0％、5％m 渍浓度下缨臆生长受羧，西25％、30％盘瀵浓度下缨藏形态交差，10％～20％ 血清浓度是rBMSC生长的适赢范围，觑清浓度过低过高均不利于rBMSC的生 长。鹏Msc袭露括志瓣鉴定显示联褥绷胞表达CD90，恧不袭达CD45，提示 本实验从大鼠众骨髓细胞分离纯化和扩增而获得的细胞属于BMSC，而非造血 类细臌。本礤究结果表职，选择使用含15％验牛盘瀵的。-MEM培莠滚进行 rBMSC原代分离培养和初期l～3代纯化培养后再改用含15％胎牛血清的 L．DMEM进程继续扩蠛培养最rBMSC体步}分离、缝化及扩增驰最优化培养条 件。 《2)磷究维生索A酸、锌及大鼠损伤脊髓提取液单独或联含使用农 体外诱导rBMSC定向分化为神经元样细胞的可能做，以期为BMSC在营养 学和神经科学领域的实际应用研究掇供进一步的依据。从大鼠骨髓中分离 培养间质于细胞并传至第4代，诱导前24h加10ng／ml碱性成纤维生长因 子(bFGF)入培葬液中以促分裂，再以会维生索A酸、锌及大鼠损饶脊髓提 取液的完全培养液(含15％FBS的L．DMEM)作诱导剂或含单独成分的完 全培养液作诱导剂进行定向诱导培养，逐日观察细胞形态变化，并采用兔 四川大学博士研究生论文 疫组织纯学法，对诱导后的分纯绥貔避行神经元特异性烯醇纯酶(NSE)、棒