牛乳中β-酪蛋构象性表位定位研究.pdf

摘要 摘要 牛乳是引起食物过敏的八大类常见食物之一。据报道，牛乳过敏引发的病 症在婴幼儿中尤为常见，1岁以下婴幼儿中的发生率约为2～3％。因此，开展牛 乳过敏的研究对于提高牛乳过敏人群生活质量具有重要的的现实意义。另外， 由于表位是食物过敏反应的物质基础，所以表位定位是牛乳过敏研究的一个核 心问题，也是人们认识食物过敏的首要任务。 本文以过敏原蛋白质13．酪蛋白为研究对象，从鲜牛乳中分离纯化13．酪蛋 白、制备特异性多克隆抗体、亲和纯化多克隆抗体、建立13．酪蛋白构象模型、 最终定位出13．酪蛋白的构象性表位，主要的研究工作和结论如下。 1．采用等电点沉淀法从鲜牛乳中得到酪蛋白，冷冻干燥后的酪蛋白粉末经 Fast Flow阴离子交换柱分离后，得到了13．酪蛋白。经过 DEAE．Sepharose SDS．PAGE电泳和等电聚焦电泳鉴定，结果表明，获得了纯度高于90％的B．酪 蛋白。 2．采用分离纯化的13．酪蛋白免疫日本大白耳兔，制备兔抗牛乳B．酪蛋白多 克隆抗体，免疫过程中利用间接ELISA方法监测免疫效价的变化，最终得到效 价分别为1：240，000和1：150，000的抗血清各一份。 3．利用溴化氰活化的Sepharose4B对抗13．酪蛋白兔血清进行亲和纯化，经 SDS．PAGE电泳检测，结果显示纯化后抗体在泳道中基本上只显示出重链 接ELISA效价测定，A、B两兔的血清效价分别从亲和纯化上样前的100，000和 高特异性的多克隆抗体。 4．分别利用同源建模、折叠识别法建模、从头预测方法对13．酪蛋白结构模 型进行构建，并对所建模型进行逐级开放式优化和Ramanchandranplot、 WHAT CHECK、ERRAT等方法评估，选择最优模型，结果得到经同源建模并 经过优化后的模型为最终的13．酪蛋白结构模型；以文献报道的针对13．酪蛋白空 间构象的实验数据作为参照，将所建模型与Kumosinski等人的13．酪蛋白典型模 型进行比较，评价本研究工作中建模结果的准确性，结果显示，与Kumosinski 等人所建模型相比，本实验所建模型更能与13．酪蛋白空间构象的实验数据吻合。 S．通过噬菌体肽库筛选得到了用于13．酪蛋白构象性表位定位的6个模拟 Il 摘要 肽；同时通过搜索得到晶体结构已解析的抗原抗体的复合物，并提取其中的表 位信息，形成数据信息库，然后对该库进行统计分析，得到表位覆盖面积大小、 表位氨基酸数目、不同种类表位氨基酸残基的出现频率、表位中起间隔作用的 氨基酸残基类型和出现频率以及表位氨基酸残基在不同蛋白质二级结构中出现 频率等信息；所得信息结合噬菌体肽库筛选结果，最终定位出B．酪蛋白的4个 构象性表位。 关键词：B．酪蛋白；同源建模；表位；牛乳过敏 III ABSTRACT ABSTRACT milkisoneofthe common isessentialinthe Bovine foods，it eight allergenic territoriesanddifferenthabits．Itis thatthemilk is different dietary reported allergy 1 theincidenceinthechildrenbelow is more children，and d