牛分枝杆菌主要泌性蛋白70和脂蛋白83的克隆表达及抗原性研究.pdf

中文摘要 牛分枝杆菌主要分泌性蛋白70和脂蛋白83的克隆表达 及抗原性研究 (中文摘要) 自1882年德国细菌学家Koch发现结核分枝杆菌以来，已报道的分枝杆菌 mycobacteri啪，n田和非结核分枝杆菌(N伽嘲Iberculosismycobact舐啪，套丌M)。 1M包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲结核分枝杆菌，又称为结核分枝杆菌 tubcrculosiS 复合群(Mycobactcrium 枝杆菌以外的其它所有分枝杆菌。 牛分枝杆菌可在人与动物之间传播，近年来发现一部分人类结核是由牛分枝 杆菌引起并有增多的趋势，已成为值得关注的公共卫生问题。牛分枝杆菌有广泛 的宿主，最为常见的是牛、獾和鹿。研究表明，感染牛分枝杆菌的动物可通过痰 液、乳汁、粪便等向外排菌而污染环境，因此，控制动物结核是控制人类结核的 重要环节。牛结核的检疫方法目前大多使用牛分枝杆菌纯蛋白衍生物(PPmM) 皮肤敏感试验(TST)，48小时才能得出试验结果，但PPD中许多抗原成分为 非致病性环境分枝杆菌和卡介苗(BCG)所共有，并不能区别非致病性分枝杆 菌和牛分枝杆菌感染，检测结果可能出现假阳性。 胶体金免疫层析方法有方便，快速等诸多优点，近年来受到广泛关注，胶 体金是指氯金酸在一些还原剂如维生素C、柠檬酸钠等的作用下所形成特定大小 的金颗粒。在适宜pH条件下，胶体金颗粒表面带负电荷，可与蛋白质所带正电 核基团形成非共价键而牢固结合，这种结合对蛋白的生物学活性无明显影响。胶 体金颗粒对蛋白质有较强的吸附作用，可与葡萄球菌A蛋白(SPA)、免疫球蛋白 等诸多生物大分子非共价结合。 两个主要抗原成分，在感染早期诱导机体产生细胞免疫和体液免疫，且抗体在血 清中的含量与疾病发展呈正相关。虽然结核分枝杆菌也存在这两个抗原成分，但 表达量极低，因此，检测MPB70和ⅧB83抗体对于牛分枝杆菌感染诊断具有 重要意义。 chaill reaction，PCR)从牛分枝杆菌基 本研究采用聚合酶链反应(polyme璐e 因组中扩增．删刀和删殇韶基因片段，分别插入原核质粒pET．32“+)，获得重 阳性克隆，阳性克隆经测序表明目的基因已插入表达质粒，核苷酸序列与牛分枝 IPT．G37 杆菌标准株AF2122／97同源性为loo％。经过表达条件的摸索，在lnIM 中文摘要 ℃诱导3小时，可获得小心B70和m但B83高效表达，目的蛋白约占菌体总蛋白 的60％以上，且目的蛋白以包涵体表达为主。pET-32a(+)表达载体因融合有硫氧 还蛋白和S蛋白，预测小伊B70分子量约为42kDa，小口B83分子量约为45kDa， 蛋白包涵体用尿素变性，半透膜透析去除尿素复性蛋白，小但B70和rMPB83纯 化后蛋白纯度可达80％以上，WB实验分析表明，小伊B70和小伊B83蛋白可与 结核病牛血清发生特异反应，说明m伊B70和心但B83蛋白具有较好的抗原性。 本研究探索了rMPB70和小位B83在胶体金免疫层析试剂中的初步应用， 用柠檬酸三钠作为还原剂来制备胶体金颗粒，并利用SPA能与多种哺乳动物IgG 结合的特性，用胶体金标记的SPA制备免疫探针，用不同浓度的m伊B70和 m位B83蛋白分别作为靶抗原致敏硝酸纤维素膜，确定rMPB70和小佃B83蛋白 的最佳致敏浓度分别为4．5mg／ml、3mg／ml。组装试纸条，并分别用TST阳性牛 血清；正常牛血清和生理盐水层析试纸条，15miII后观察结果。实验室初步考核 显示，用小伊B70蛋白制备的胶体金试剂检测30份TST阳性牛血清，20份呈阳 性，敏感性66％；用m位B83蛋白制备的的胶体金试剂检测30份TST阳性牛血 清，22份呈阳性，敏感性73％。而分别检测正常牛血清和生理盐水均呈阴性， 显示本研究获得的rMPB70，rMPB83蛋白可以