白藜芦醇抗心肌血再灌注损伤的线粒体机制研究.pdf

JIII lllPIffllllllfllrflllljlll rPiIrll0 Y20421 57 摘要 摘要 白藜芦醇是一种生物活性多样的多酚类化合物，主要存在于葡萄、花生、 虎杖等食品和药材中。白藜芦醇具有良好的心血管保护、抗衰老、抗肿瘤等营 养保健作用，是分子营养学和药理学热门研究对象之一。近年来国内外研究发 现白藜芦醇具有显著的抗心肌缺血再灌注损伤保护作用，但其作用机制尚不明 确。线粒体为心肌中含量最丰富的细胞器，白藜芦醇对心肌损伤的保护作用， 很有可能与线粒体相关。线粒体不仅为心肌提供能量，而且在维持细胞的Ca2+ 稳态、调节细胞凋亡或坏死等过程中起着决定性作用，其功能障碍与线粒体通 透性转换孔道(mitochondriatransition permeabilitypore，mPTP)密切相关。m门P 的开放是缺血再灌注损伤从可逆向不可逆过渡的一个关键因素。其中位于椰 anion channel，VDAC)控制着 外膜上的电压依赖性阴离子通道(voltage．dependent 离子和代谢物的转运，对于mPTP的开放和关闭起重要作用。故我们推测VDAC 可能是白藜芦醇的抗心肌缺血再灌注保护作用的线粒体靶点。 过体外缺血再灌注损伤模型，即缺氧／复氧(A／R)损伤模型，测定在VDACl蛋白 正常表达、低表达和高表达，以及细胞外液无Cl。等不同情况下，白藜芦醇对心 肌细胞、线粒体功能及线粒体介导的凋亡通路的作用。利用流式细胞仪测定细 胞内或线粒体内Ca2+、活性氧(ROS)深度变化，荧光分光光度计检测Cl。浓度的 变化，以进一步阐明白藜芦醇对急性心肌损伤保护的分子生物学机制。现将本 论文主要研究结果归纳如下： 1．探讨了白藜芦醇对H9c2心肌细胞A／R损伤保护作用的量效关系。MTT 法检测细胞存活率；按试剂盒说明测定细胞内LDH和CPK的活性、MDA含量 以及抗氧化物酶SOD和GSH—Px的活性；流式细胞法检测心肌细胞内Ca2+浓度、 ROS、线粒体膜电位及细胞凋亡；分光光度计法测定II∥冲的开放。结果发现 50州的白藜芦醇可发挥最佳心肌保护作用，降低LDH和CPK活性，提高心肌 I 摘要 细胞存活率，提高抗氧化酶SOD和GSH．Px活性，减少ROS生成和MDA含量， 防止钙超载和mPTP开放，维护线粒体膜电位，减少细胞凋亡。 2．Western blot法检测白藜芦醇及A／R损伤对VDACl表达的影响。结果发 现A／R损伤可上调VDACl的表达，而白藜芦醇则可抑制VDACl的表达。 义。结果表明，RNAi特异性沉默VDACl后可显著减轻A／R后的氧化应激、钙 c)的释放 超载、维护线粒体膜电位，防止mPTP开放，从而抑制细胞色素c(Cyt 及线粒体凋亡通路激活中发挥着重要的作用。 VDACl蛋白高表达组，通过反向验证进一步明确白藜芦醇心肌保护作用与 用，说明白藜芦醇的心肌保护作用就是由VDACl介导的。 5．深入探讨VDACl参与mPTP开放的调节机制。通过流式细胞仪检测线 粒体内Cl’浓度发现，A／R损伤时线粒体内Cl。浓度明显升高，而利用RNAi下调 VDACl水平则可减少线粒体内Cl‘浓度，并且白藜芦醇预处理或去除细胞外Cl- 也可有效降低线粒体内Cl。浓度，导致Ca2+浓度下降，ROS生成减少，防止mPTP 开放。此结果说明VDACl就是Cl。进出线粒体的主要通道，并且Cl一在mPTP开 放调节和VDAC介导的白藜芦醇抗急性心肌保护作用及线粒体功能维护中发挥 着重要的作用。 上述结果表明：白藜芦醇通过抑制A／R损伤时VDACl