端粒酶活性的检方法及应用研究.pdf

华中群或式学周济压学臃 博士学芷论艾 摘要 々更嘻：)∥二0已h，第一章．端粒酶及其研究进展， f近年来的研究发现，细胞癌变与衰老受到细胞染色体两端的重复 { 序列——端粒长度的控制，而端粒是由端粒酶(telomerase)特异合成。端 粒酶是一种能将真核生物染色体末端端粒DNA加以延伸的酶，它由蛋白质 和RNA两部分组成，是一种核糖核蛋白，具有逆转录酶(reverse 复序列。已经在包括人类的多种生物中克隆了端粒酶的RNA，人端粒酶 Telomerase RNA组份的基因，命名为hTR(human RNA)基因。但hYR的水 平在多种肿瘤中与端粒酶的活性并不平行。最近对人类端粒酶蛋白质催化 TelomeraseReverse 亚单位hTRT(human transcriptase)研究取得了较大的 进展，hTRTmRNA表达水平与端粒酶的活性密切相关． 正常人的体细胞的端粒都随衰老而缩短，随着细胞的不断分裂，端粒的 长度将越来越短，当达到一个临界(crisis)长度，细胞染色体即失去稳定性， 细胞将发生衰亡或凋亡(apoptosis)。端粒的长度决定了细胞的寿命，因此被 clock) 形象地称之为有丝分裂钟(mitotic 。例外的是：生殖细胞的端粒却 不断地被其端粒酶所加长，而得以永久性地分裂增殖。这被解释为是生物进 化中维持种系生存的需要。异常的是：绝大多数的恶性肿瘤细胞中重新出现 了端粒酶的活性，发挥其合成端粒的功能，补偿(componsate)正常的端粒 丢失。如此，这个细胞就不能进入正常的老化和衰亡，从而获得了一种“永 久性”(immortolity)。“端粒．端粒酶”假说的提出，提示端粒酶再激活可能 是肿瘤发生过程中多步基因改变中的至关重要的一步。而目前大量的研究报 道已发现在绝大多数人类的肿瘤细胞中，都有端粒酶活性存在，恶性肿瘤组 半中科或丈学周，哜压学臃 搏窖学芷般 断标记物的特异性为91％，敏感性为85％。而正常体细胞(除外生殖细胞及造 血干细胞)检测不到端粒酶活性或仅检测到低水平的端粒酶活性。 探测细胞内端粒酶活性需要有灵敏准确的测定方法。近年来建立的TRAP (telomeric repeat 量，大大提高提高检测的灵敏度。目前应用最广的端粒酶活性分析方法就是以 TRAP法为基础的各种方式。但总的来说还缺乏灵敏度和特异性高，定量准确 的检测端粒酶活性的方法。建立端粒酶的准确定量系统和量化各种正常与肿瘤 组织端粒酶表达，是在临床应用端粒酶作为肿瘤诊断和判断预后的关键。 目前有许多生物技术及制药公司正在以端粒酶为靶点，发掘端粒酶抑制 剂作为治疗肿瘤的有效药物。端粒酶是目前已知的最为广谱的肿瘤分子标记 、 物，并且有可能成为肿瘤治疗的新靶点。对端粒酶的研究还处在方兴未艾之际厂7 第二章． 端粒酶活性定性检测方法的研究． 目的：探讨TRAP．银染法、TRAP．SYBRGreen染色法定性检测端粒酶 活性的方法，以及利用适配分子(Aptamer)提高TRAP法检测灵敏度的可能。 (方法： 采用TRAP-银染法定性检测293细胞株、白血病细胞株及不同阴性对照 组标本的端粒酶活性；采用TRAP．SYBRGreen染色法检测A549肺腺癌细胞株、 293细胞株、HL．60白血病细胞株、6例肺癌组织及各阴性对照样本的端粒酶活 性的表达；将A549细胞株稀释成阳性系列样本，每样本分为正常组和实验组两 的方法检测端粒酶活性。结果：不同pH值的显色液、凝胶的纯度和厚度、不 同电泳条件对银染结果均有影响，利用TRAP一银染法检测端粒酶活性，能显示 5