10真核生物表达系统要点.ppt

哺乳动物细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统是生产天然蛋白的理想表达系统，是目前应用最广泛的动物细胞表达系统。其优点和缺点都极其显著。产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质最接近，糖基化等后加工最精确。一般会产生正确加工的、有活性的蛋白。 哺乳动物细胞表达体系的优点 哺乳动物细胞表达体系的种类和数目已经发展很快。 哺乳动物细胞表达体系有很多其他体系不能与之相比的优势。它具有复杂的翻译后加工系统，糖基化以及二硫键在合成和分泌过程中自然而然的正确形成。哺乳动物细胞具有产生正确折叠和完全生物活性的蛋白质。 分泌型哺乳动物细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统可以通过设计，使外源重组蛋白直接分泌到培养基中。这个重组表达单位包括N末端的信号肽，其作用是起始新生肽链插入到内质网中，此信号肽在分泌过程中被切除，从而产生具正确N端的重组蛋白质。从内质网到高尔基体再到细胞外空间的分泌过程产生糖基化和防止蛋白被胞内蛋白酶水解。分泌过程也使蛋白质二硫键正确配对和正确折叠。 逆转录病毒是RNA病毒，RNA基因组转变成DNA，能有效地整合到宿主基因组中，长久地在宿主基因组中寄宿，并在每次细胞分裂时，随宿主DNA一起复制。 整合的原病毒依靠基因组末端的强启动子(长末端重复LTR序列）稳定地产生病毒RNA。此病毒RNA既产生病毒蛋白质的mRNA，又产生新病毒的基因组RNA。 杆状病毒DNA 杆状病毒能够感染昆虫细胞的DNA病毒，将外源基因克隆在携带一部分病毒基因组、且位于病毒外壳蛋白基因位置的质粒上。用重组质粒与野生型杆状病毒DNA一起共转染昆虫细胞，质粒和病毒DNA通过同源重组，将外源基因插入到病毒基因组中。 基因枪介导的DNA转移 基因枪法最早是由美国康奈尔大学的Sanford最先提出的。它通过高速飞行的金属颗粒将包被其外的目的基因直接导入到受体细胞内，从而实现基因转化的方法。1992年，世界首例转基因小鼠就是通过该法获得的。 基因枪转化的原理 脂质体介导法 脂质体：人工构建的由磷脂双分子层组成的膜状结构。 原理：受体细胞的细胞膜表面带负电荷，脂质体颗粒带正电荷，利用引力作用，把DNA、mRNA及单链RNA等导入细胞内 过程： 在形成脂体时，把用来转染的目的DNA分子包在其中 将该种脂质体与细胞接触 外源DNA分子导入受体细胞 主要适用于真核细胞 gfp基因的检测 绿色荧光蛋白是一些腔肠动物所特有的生物荧光素蛋白。生物荧光素蛋白是指存在于生物体内，能在激发光作用下发射出荧光的蛋白质。它可与目的基因构成嵌合基因，从报告基因的表达了解目的基因表达情况。 检测方法：对于转化细胞可用蓝光照射，在显微镜下分拣发出强烈绿色荧光的细胞。对于转化植株，可在激发光照射下利用解剖照相系统进行绿色荧光蛋白检测和定位。 主要的植物细胞基因表达受体系统 愈伤组织再生系统：由外植体经脱分化培养、诱导愈伤组织并通过分化培养获得再生植株的受体系统。 特点： 易于接受外源基因、转化效率高； 扩繁量大，可获得大量的转化植株； 但获得的再生植株无性系变异较大、外源基因的稳定性较差。 主要的植物细胞基因表达受体系统 直接分化再生系统：是外植体细胞不经过脱分化阶段而直接分化出不定芽而获得的再生株。 特点： 获得再生植株的周期短，细胞无性系变异小能较好地保持受体细胞的遗传稳定性； 转化频率相对较低，存在较多的嵌合株。 主要的植物细胞基因表达受体系统 原生质体再生系统。 特点： 能高效地转化外源基因，可形成基因型一致的细胞克隆 培养周期较长、难度大； 再生频率较低； 在原生质体的培养过程中易造成变异。 主要的植物细胞基因表达受体系统 胚状体再生系统：是指体细胞或单倍体细胞在组织培养条件下诱导成为形态和功能上类似于有性胚的胚状体，是一种最理想的转化受体系统。 特点： 具有很强接受外源DNA能力、转化效率高； 获得的嵌合体少； 胚状体具有两极性，在发育过程中可同时分化出芽和根、形成完整的植株； 利用胚状体可生产人工种子。 主要的植物细胞基因表达受体系统 生殖细胞受体系统：是以生殖细胞如花粉、卵细胞等作为基因转化的受体细胞，通过组织培养技术将生殖细胞诱导成为胚性细胞或愈伤组织，或直接利用花粉和受精卵受精过程进行基因转化。 特点： 转化效率高，易于获得稳定的遗传； 通过加倍后成为纯合的二倍体。 原生质体介导法 概念：以原生质体为受体，借助于特定的化学或 物理手段将外源ＤＮＡ直接导入植物细胞 的方法。 主要方法: 1) PEG介导的基因转化 2) 脂质体（liposome)介导的基因 转化 3) 电激