发酵条件及工艺控制资料讲解.ppt

（2）菌体分离法 过滤法、离心法 A过滤法：选择适当的滤纸，就能用比较简单的装置进行分析。 滤纸：深层滤纸、表面滤纸。 深层滤纸：如定性、定量的纤维滤纸和玻璃纤维滤纸使颗粒保留于滤纸基质内，属于深层滤纸。 表面滤纸：醋酸纤维素和硝基纤维素制成的薄膜滤纸，颗粒能够保留于孔径均一的薄膜表面，是表面滤纸。不适用于收集大量（如细胞的）过滤收集，一般只适用于细胞数较少的样品的浓缩、微生物的分析和培养基的过滤除菌。 收集菌体时滤纸的选择： 主要考虑滤纸颗粒的保留性，按细胞的大小、形状考虑最适合的滤纸。 颗粒保留性能是指能保持总颗粒数98%的颗粒孔径大小（μm）。 几种常用滤纸的保留性能： 薄膜滤纸为0.1-0.5 μm ； 玻璃纤维滤纸为0.7-2.7 μm ； 定性、定量纤维素滤纸为2.5-25 μm。 收集细菌、真菌（如酵母菌）等微生物时，多数用玻璃纤维滤纸（如Whatman公司出品）。它耐550℃的高温。 方法：滤纸铺在Buchner漏斗或较容易拆分和清洗的三件一套的漏斗上进行抽真空过滤。注意滤纸先要在室温下进行真空干燥并称重。 过滤前对发酵液的处理： 如培养时用碳酸钙作中和剂，要先用盐酸或醋酸溶解；如培养过程中有蛋白质生成沉淀造成过滤困难，或液体黏度因多糖的存在而显著上升，可采取加热、添加絮凝剂及酶水解等。 一般1L培养基使用1-3gCaCl2或Al2（SO4）3作为絮凝剂。或添加一些助滤剂。 B离心法： 酵母分离时用的离心机的分离因数为1200-3000g；细菌为5000-8000g；离心时间为5-10min （所需转数为n），如在3000g时，可用下式求得：n=3000/1.11×10-5 ×γ再开方 γ为旋转轴到离心管中心得距离（cm） 注意：当细胞浓度很小时，如细菌浓度为107个细胞/ml以下时，离心得到得菌量很少，特别是离心机停止运转后的操作中上浮的细胞，给菌量的检测带来误差；清洗收集的细胞有时也会造成损失。 （3）干燥 105℃的常压干燥（约3h）、80℃或40℃下的减压干燥、冷冻干燥。 温度每下降10℃，干燥时间延长一倍。 （4）称量 干燥后的细胞具有吸湿性。用自动天平迅速称量，就不用专门使用具塞称量瓶。冷冻干燥的样品吸湿性强，最好在低温下称量。 （5）湿重法 不对菌丝进行干燥，但要用适当滤纸收集20-50mL发酵液，从滤纸上取下菌丝，夹入2-3枚重叠的新滤纸中间，用手按压，使其充分吸水，反复操作2次后剥下菌丝称量。 一般湿重相当于干重的2.5-5.0倍，事先求出它与干重的关系，即可有效跟踪观察培养过程，收集的湿细胞在以后的细胞成分分析及生理实验中也可使用。 2、比浊法 为了及时了解发酵过程中微生物的生长情况，需要定时测定发酵液中微生物的数量，以便及时的控制发酵条件，获得最佳培养物。常用的就是比浊法。 现常用的是光电比色计。 波长500-660nm，需要绘制标准曲线。 标准曲线的绘制 取大约100ml的发酵液，约20ml用于测定浊度，其余用于测干重求出细胞的浓度。 原液的吸光度在0.3以下时应离心分离，将细胞浓缩。 用缓冲液或原液离心后的上清液等稀释至原液，原液×0.8，原液× 0.6，…，原液× 0.2，原液× 0.1。 由OD值及细胞浓度的测定结果绘制标准曲线。 吸光度在0.05-0.3的范围内，吸光度与细胞浓度呈线性关系。 测定中应注意的问题 菌株、培养条件、测定条件（光电比色计、试样细胞、波长）与作标准曲线时相同，并仍用同样的稀释液稀释至吸光度至0.3以下时再进行测定。 反之，培养条件、测定条件改变时，要作新的标准曲线。 培养时发生凝集时，可加入阴离子性或非离子性表面活性剂（Tween,Triton） 3、填充重量法 使用带刻度的离心管。 在较厚的细管部分的最小刻度单位是0.01mL，5mL容量可读至0.01mL。适用于细菌（一般不用）、酵母菌及孢子。 在10mL容量中最小刻度为0.1mL。适用于菌丝。 如酵母菌，其离心条件为1200g ，10min。为将其换算成干重，用部分发酵液先求出填充容量与细胞干重的关系。但要注意细胞浓度需大到一定程度。如酵母的适当浓度为10mg干燥细胞/mL。 4、间接测定法 全氮测定法（样品少时用，费时间） 根据其他细胞成分进行测定（如核酸等成分） 由细胞外的物质变化来推定（根据培养基质的减少和产物的增加也能推定培养细胞的浓度，其中应用较多的氧吸收速度IO2，如大型发酵罐中可由进气、出出气浓度是差来连续测定） 指搅拌器搅拌时所消耗的功率，常指每立方米发酵液所消耗的功率（kW/m3）。 它的大小与溶氧传递系数KLa有关。 （4）搅拌功率 指单位时间内单位体积发酵液通入空气的体积。 它的大小与氧的传递和其它控制参数有关。 一般控制在0.1～1.0vvm之间 vvm：每分钟通气量与罐