生化实验三 组织匀浆的制备方法和琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察.ppt

实验三琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察血液样品的处理与组织匀浆的制备 学习血液样品的处理与组织匀浆的方法。 学习离心机的使用方法。 进一步理解酶的竞争抑制原理。 实验目的： 实验原理 琥珀酸脱氢酶催化底物琥珀酸脱氢生成产物延胡索酸，同时脱下来的氢在有氧的情况下经过一系列的传递体最后传给氧而生成水。 本实验设计在无氧的条件下使底物脱下来的氢交给氧化型的受氢体甲烯蓝（蓝色）使之成为还原型受氢体甲烯白（无色），通过观察蓝色到无色的变化从而了解脱氢酶的活性。 HOOC—CH2—CH2—COOH HOOC—CH=CH—COOH FAD FADH2 MBH2甲烯白（无色） MB甲烯蓝（蓝色） 在无氧条件下，以甲烯蓝褪色时间来判断琥珀酸脱氢酶活性的改变。 琥珀酸脱氢酶 竞争性抑制作用 抑制剂(I)与底物(S)的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。 反应模式 + I EI E + S E + P ES [S][I]：高浓度的底物可解除抑制 竞争性抑制作用特点 1、I结构常与S结构类似 2、I/S与酶的结合部位相同:酶的活性中心 3、[S]↑可以降低甚至消除抑制作用 4、(表观）Km值增大，Vm值不变 实验器材与试剂: （一）试剂 pH=7.4 磷酸缓冲液 1.5% 琥珀酸钠溶液 1% 丙二酸钠溶液 0.02% 甲烯蓝溶液 生理盐水 液体石蜡 实验器材与试剂： （二）器材 研钵、手术剪、手术镊子 2 mL 移液管 1000 uL微量可调仪器 10 mL 离心管 低速离心机等 实验操作： 1. 琥珀酸脱氢酶酶液的制备 1 g 猪心 匀浆 上 清 液 （酶液） 剪碎， 3-4ml 1/15mol/L Na2HPO4 6-7ml, 1/15mol/L Na2HPO4 2000r / min 离心10min 放置20min 细胞破碎 抽提 分离 2. 琥珀酸脱氢酶的作用及酶竞争抑制作用的观察 单位：滴 试管号 心脏提取液 琥珀酸钠 丙二酸钠 蒸馏水 甲烯蓝 1 5 5 - 25 2 2 5 (煮沸) 5 - 25 2 3 10 5 5 15 2 4 10 20 5 - 2 混匀，立即加5-10滴液体石蜡封面 置37 ℃ 和沸水浴，30min 内观察各管颜色变化 结果：各试管颜色由蓝变白速度快慢依次为：？ 原因分析：1号？2号？3号？4号？ 1 心脏一定要充分研磨至糊状，使琥珀酸脱氢酶尽量释放到溶液里 2 离心时注意离心管一定要精确平衡，并将重要相等的离心管对称放置 3 离心结束后拿取离心管时动作要轻柔，不要振荡离心管，以免糜液重新变浑浊 注意事项： 三、实验报告要求： 原理 琥珀酸脱氢酶催化的反应、酶的竞争性抑制作用、本实验脱氢酶活性观察的原理。 操作（用表格表示） 结果 结果说明 思考题： 1: 为什么反应开始后，反应液必须静止，不能再摇动? 2：抑制剂还可以选用什么物质？ 3：利用本实验的数据，说明酶竞争性抑制的特点？ 实验内容二 血液样品的处理与组织匀浆的制备 ㈠ 血液和组织样品的采集 在实验动物功能评价中，需要采集的生物样品主要是血液和组织脏器，它是反映受试物的生物学效应和物质在体内代谢情况的最为重要的途径。 1．采血 2．组织匀浆制备： 将动物组织细胞在适当的缓冲液中研磨，使细胞破坏，细胞内容物溶解或悬浮于缓冲液中形成混悬液。 ㈡生物材料的处理 1．血液样品 ①全血：即抗凝血，主要用于Hb、RBC、WBC等 一些生化指标的测定。 ②血浆：抗凝血离心分离，除去细胞成分所得。 主要用于凝血、纤维蛋白和一些生化指标的 测定。 ③血清：不加抗凝剂，自然凝固后析出的澄清淡黄色 透明液体。 2．血液样品的区别 ①血浆与血清的区别 血浆：抗凝采血后立即分离，含有纤维蛋原和前凝血酶 血清：血液凝固，血清析出后分离，不含纤维蛋原和前 凝血酶。 ②全血一般用于血细胞分析，不宜作系列化分析。 生化分析一般用血清或血浆。 3．常用抗凝剂 ①EDTA—