第二章菌种保藏.ppt

5、砂土管保藏法 适用于细菌的芽孢、霉菌和放线 菌孢子的保藏，不适于对干燥敏感的 无芽孢的细菌和酵母菌。 将孢子悬浮液转移至灭过菌的砂土管中，于真空干燥器内用真空泵抽干，再转至有干燥剂的容器中，密封低温保藏。本方法是用人工方法模拟自然环境使菌种得以栖息。 主要包括砂土（河沙：土壤=3：2或1：1）制备和真空抽干两步。 河（海）沙过筛、 浸泡、洗涤 菜园土过筛与沙混合 沙：土＝3：2或1：1 小试管分装1cm、灭菌 斜面培养物用无菌水制成孢子悬液106/ml 无菌加入1ml 孢子悬液 混匀 真空干燥器内干燥 管口熔封、低温保存 6、真空冷冻干燥法 适用于细菌（有芽孢和无芽孢的）、酵母、霉菌孢子、放线菌孢子和病毒等。 此法的原理是在低温下迅速将细胞冻结以保持细胞结构的完整，然后在真空下使水分升华。这样菌种的生长和代谢活动处于极低水平，不易发生变异和死亡，因而能长期保存，微生物在此条件下易死亡，所以需加入一些物质作保护剂，一般常用的是脱脂牛奶、血清等。 优点：该法存活率高，变异率低，应用广泛，保存时间长，一般为5-10年。 缺点：是手续麻烦，操作复杂，要求严格，并需有一定设备条件。 安培瓶准备 菌种用脱脂乳制成悬液 （108-1010/ml） 火焰熔封管口 低温、真空干燥 （水分达1-3%） -30—-40℃ 20-60min 冷藏或冷冻保藏 -30℃以下的低温干燥箱，真空度达66Pa,缓慢升温干燥 菌种呈酥块或松散片状 7、液氮超低温保存 大多数病毒、噬菌体、立克次 氏体、放线菌、支原体、霉菌、酵 母、细菌、藻类和原虫，特别是冷 冻真空干燥法无法保存的微生物。 把将要保存的菌种（菌液或琼脂块）置于10%甘油等保护剂中，密封于安培瓶内，先将菌液降至0℃，再以每分钟降低1℃的速度降至-35 ℃，然后将安培瓶放入液氮瓶中保存（-150 ℃以下达-196 ℃） （三）保存菌种的注意事项 1.菌种保藏前所处的状态 （1）休眠体（如孢子或芽胞） （2）新鲜的、生长良好的斜面培养物 2.菌种保藏所用的基质 （1）斜面培养基碳源比例较低 （2）保藏所用基质应不含其他有机物质 （3）保护剂灭菌时防止有害物质的产生 3.防止操作过程中对细胞结构的损害 （1）加入保护剂 （2）冷冻时防止形成冰晶 二、菌种的复壮 （一）菌种的提纯 1.退化不严重时用划线分离法或稀释分离法 2.退化严重时用单细胞分离法 （1）在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。 （2）用特制的毛细管用显微镜在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培养基进行培养。 （二）菌种复壮 1.淘汰已衰退的个体 2.选择合适的培养基 3.通过寄生体复壮 第三节 国内外主要的菌种保藏机构 一、国内菌种保藏机构 1.中国典型培养物保藏中心 简 称：CCTCC 所 在 地：武汉大学 邮 编：武汉430072 保存范围：专利菌种 2.普通微生物菌种保藏中心 简 称：CCGMC 所 在 地：中国科学院微生物研究所（北京） 中国科学院病毒研究所（武汉） 邮 编：北京100080 武汉430071 保存范围：真菌、细菌、病毒 3.农业微生物菌种保藏中心 简 称：ACCC 所 在 地：中国农业科学院 土壤肥料研究所 邮 编：北京100081 保存范围：农业微生物 4.工业微生物保藏中心 简 称：CICC 所 在 地：轻工部食品发酵工业研究所 邮 编：北京100027 保存范围：工业微生物 5.医学微生物菌种保藏管理中心 简 称：CMCC 所 在 地：中国医学科学院皮肤病研究所（南京） 中国药品生物制品检定所（北京） 中国医学科学院病毒研究所（北京） 邮 编：南京210042 北京100050 北京100050 保存范围：真菌、细菌、病毒 取含有 9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。 将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。 将试管于震荡机上，使菌液混合均匀 取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL， 加入另一个新的含9mL无菌水的试管中。 重复此步骤直至所需要的稀释浓度。 从最后稀释菌液中吸取 0.1mL菌液，