第五章 基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达.pptxVIP

第五章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达第一节基因的表达系统与表达策略第二节基因在大肠杆菌中的高效表达第三节基因在酵母中的表达第一节基因的表达系统与表达策略基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。最佳的基因表达体系：⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。宿主细胞的选择1、容易获得较高浓度的细胞2、能利用易得廉价原料3、不致病、不产生内毒素4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态5、容易进行代谢调控6、容易进行DNA重组技术操作7、产物的产量、产率高8、产物容易提取纯化一适合目的基因表达的宿主细胞的要求二宿主细胞分为两大类1原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等2真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。②有各类菌株和载体系列。③目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。④易培养，成本低。优点缺点①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性③蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基④其内毒素很难除去。酵母酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。基因表达的基本过程基因的表达主要涉及到两个过程：转录和翻译。首先，目的基因通过转录(transcription)形成mRNA（信使RNA,messengerRNA)；然后，tRNA（转运RNA,transferRNA）将各种氨基酸运送到核糖体并按照mRNA的密码子顺序将各种氨基酸连接成特定的氨基酸序列(translation)最终得到基因的表达产物（蛋白质）。Transcription(转录):makinganRNAcopyofaDNAsequence.RNApolymeraseopensthepartoftheDNAtobetranscribed.OnlyonestrandofDNA(thetemplatestrand,antisensestrand)istranscribed.转录的具体过程有效转录的基本条件启动子（promoter）：在基因序列中，标志着转录起始的可被RNA聚合酶识别的位点(DNA区段)，一般位于基因的上游。终止子（terminator）：位于基因的编码序列之外（一般在下游）的一段标志着转录停止的RNA聚合酶识别位点。1具备起始密码子2具备终止密码子3具有正确的阅读框正确翻译的基本条件根据表达蛋白用途选择基因的表达策略一生物化学和分子生物学研究二表达蛋白质用作抗原三结构研究真核基因表达的特点基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强子序列存在一条成熟的mRNA只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物那样的多基因操纵子模式基因转录调节区很大，而且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基，它们并不直接影响RNA聚合酶与启动子区的结合，而是通过改变基因5’上游区DNA的构型来影响RNA聚合酶与启动子区的结合mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程原核体系中表达真核基因的困难细菌的RNA聚合酶不识别真核基因的启动子；真核基因转录的mRNA在原核细胞中不能结合到核糖体上；真核基因一般含有内含子，而原核细胞没有象真核细胞那样的转录后加工系统，所以mRNA中的内含子部分不能被切除，不能形成成熟的RNA，也就不能表达出有功能的真核蛋白；表达的真核蛋白在原核细胞中很不稳定，容易被细菌蛋白酶降解破坏。⑴将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。⑵采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的基因，这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的问题。⑶构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降解，最后可以将融合多肽切除。构建表达载体的策略大肠杆菌表达载体的成份大肠杆菌基因表达系统的表达载体一般是质粒表达载体，含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点和有关序列组成的能在大肠杆菌中有效复制的复制子。第二节克隆基因在大肠