第十章高相液相色谱法.doc

第十章 高效液相色谱分析 §10-1概述 高效液相色谱（HPLC）是现代分析化学中最重要的分离分析方法之一。最初的色谱分析法就是经典的液相色谱法，但由于其分析效率低，因此，很长时间没有得到发展，在七十年代以前，液相色谱的发展和应用远远落后于气相色谱。1969年第一台高效液相色谱仪制成，70年代后，新型填充剂、高压输送泵、梯度洗脱技术以及各种高灵敏度的检测器相继发明，现代液相色谱才的以真正发展。 现代液相色谱和经典的液相色谱法相比有以下主要特点： 项目 经典色谱 HPLC 特点 柱效（n/m） 2~5 103~5×105 ①高效 分离时间（h） 1~20 0.05~1 ②高速 试样用量（g） 1~10 10-7~10-2 ③高灵敏度 柱入口压强（KP） 1~100 2×103~3×104 固定相粒度（μm） 75~600 3~10 检测手段 洗出液定性分析 检测器柱后检测 装置 手工操作 自动操作 ④高度自动化 §10~2HPLC分类及其分离原理 HPLC一般按其分离机理的不同分类。主要有：L-L色谱法、L-S色谱法、离子交换色谱法、离子对色谱法、离子色谱法和空间排阻色谱法。 一、L-L色谱法（分配色谱法） 原理：和GLC相似，分配系数K=Cs/Cm=k×Vm/Vs 根据流动相和固定相的极性不同可分为： 1、正向LLC：流动相极性固定相极性，极性小的组分先流出色谱柱，适合极性物质分离。 2、反向LLC：流动相极性固定相极性，极性大的组分先流出色谱柱，适合非极性物质分离。 与GLC不同的是液相色谱发在流动相对分配系数的影响更大。 固定相和流动相理论上应不互溶，但实际上仍有微量溶解，而且机械冲击作用也会导致固定相流失，从而使柱的分离效率和选择性降低。可采用化学键合固定相来克服这一问题。 化学键合固定相：将固定相各种不同的有机基团通过化学反应共价键键合到载体（硅胶）表面的游离羟基上。 二、LSC（吸附色谱法） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂 原理：利用组分吸附作用的不同来进行分离 机理：组分分子（X）和溶剂分子（S）对吸附剂（固定相）表面有竞争性吸附： Xm+nSa Xa+nSm 式中： Xm—流动相中组分分子，Sa—吸附剂表面的溶剂分子 Sm—流动相中溶剂分子，Xa—吸附剂表面的组分分子 平衡时：K=[ Xa][ Sm]n/[ Xm][ Sa]n K越大，组分分子在固定相上吸附能力越强，保留值越大。 三、离子交换色谱法 原理：离子交换剂上可电离的离子与流动相中组分离子进行可逆的离子交换，利用试样中不同组分与离子交换剂具有不同的亲和力而将它们分离的方法。 离子交换式：R-A+B R-B+A 平衡时：KA/B=[B/][A]/[B][A/ ] 式中： KA/B—试样在两相中选择系数 [A/]—离子交换剂中A的浓度 [B/]—离子交换剂中B的浓度 [A]—流动相中A的浓度 [B]—流动相中B的浓度 KA/B越大，B组分对A 离子交换剂的亲和力越大，保留值越大。 离子交换色谱存在两个显著缺点： 1、不能耐受过高或过低的pH，因此分析强酸、强碱时受到限制； 2、流动相中强电解质背景对电导检测器的干扰造成测定困难。例如：R-OH-+Na+Br- R-Br-+Na+OH- 洗脱液中OH-的电导比Br-的电导大的多，因此无法测定。为克服以上缺点，在传统的离子交换色谱法的基础上发展了另两种分析方法，即离子对色谱法和离子色谱法。 离子对色谱法：与待测离子电荷相反的离子（对离子）加到流动相或固定相中，使其与待测离子形成离子对化合物，利用在种离子对化合物在两相中分配系数的不同而进行分离的分析方法。可分为： 正相离子对色谱法：非极性固定相，极性流动相 反向离子对色谱法：极性固定相，非极性流动相 离子对色谱法可用紫外检测器、荧光检测器。 离子色谱法（1975年Small提出）：色谱柱后增加一个化学抑制柱，使洗脱也中背景离子变为低电导性物质。前面的例子中增加一条强酸性柱，则OH-+ H+=H2O，消除了OH-的影响。 四、空间排阻色谱法（凝胶色谱法） 用于分子量大于2000的组分分离 原理：试样中分子量大小不同的组分进入凝胶柱时，题目渗入微孔的程度不同，大分子直接从间隙中越过，首先出柱，分子越小，进入微孔月深，保留值越大，溶剂分子通常最小，最后流出，组分一般在死时间前出柱。 §10-3固定相和流动相 固定相 1、LLC固定相 1）固定液涂渍在担体上，分为全多孔型和表面多孔型 2）化学键合固定相 常用的固定液有：极性的-氧二丙青（ODPN），非极性的十八烷（ODS），异二十烷（SQ）等。 2、LSC固定相 有薄膜型硅胶、全多孔型硅胶，薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛和聚酰氨等。