娑罗子多糖的提取_含量测定及生物学活性研究.docxVIP

源森生物娑罗子提取多糖的含量测定及生物活性研究实验 近年已有研究表明，娑罗子多糖具有增强免疫、抗氧化、抗衰老及抑菌作用。本次实验，西安源森生物采用陕西汉中产娑罗子微原料进行提取，测定其多糖含量及生物学活性，以期为娑罗子多糖的进一步临床应用提供参考资料。一、 源森生物娑罗子提取物多糖含量及活性研究实验的材料与方法（一）实验材料与仪器1. 实验材料娑罗子，采于陕西汉中天台山→烘干，粉碎过40目筛；实验菌株冻干品；葡萄糖、乙醚、无水乙醇、95%乙醇、丙酮、浓硫酸、苯酚、三氯乙酸、浓盐酸、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、30% 双氧水、抗坏血酸、邻菲啰啉国产分析纯；1,1-二苯基苦基苯肼、叔丁基对苯二酚；色谱纯；三羟甲基氨基甲烷；纯净水。2. AB204-S型电子分析天平；HH-4型电热恒温水浴锅；RV10旋转蒸发仪；UV-2550紫外分光光度计；PYX-DHS隔水式电热恒温培养箱；KQ5200DE型数控超声波清洗器；sigma 3K30离心机，500mL索氏提取仪，96 孔培养板。（二）源森生物娑罗子提取多糖含量实验方法1. 娑罗子多糖的提取（1）粗多糖的提取 称取娑罗子药材粉末60.0g，以乙醚为溶剂，45℃索氏提取回流去脂至乙醚为无色；药渣挥干乙醚，置于圆底烧瓶中，用95%的乙醇回流2h，以去除单糖、低聚糖及其它醇溶性杂质，重复上述操作一次；将药渣烘干后用纯净水在90℃水浴中回流提取三次，每次2h→趁热抽滤→合并滤液→减压浓缩至适当体积→加无水乙醇使醇含量达75% 以上→静置过夜→抽滤得多糖→分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤三次→50℃干燥→得娑罗子粗多糖3.76g。（2）精制娑罗子多糖称取2.0g粗多糖→100mL纯净水溶解→加入1.5倍量5%的三氯乙酸→充分振摇→抽滤，弃去蛋白沉淀→滤液减压浓缩至适量体积→加入无水乙醇使含醇量达75%以上→静置过夜→抽滤→洗涤→干燥→得去蛋白多糖。2. 娑罗子多糖含量测定（1）标准曲线的制备 精确称取105℃干燥至恒重的葡萄糖0.1000g→纯净水溶解后定容于100mL的容量瓶中→摇匀→吸取此溶液100mL定容于容量瓶中→摇匀→配成浓度为 0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液。精密吸取葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL置于洁净试管中→分别加水补齐至2.0mL→另取一管加2.0mL纯净水作为空白对照。各试管再分别加入6%的苯酚溶液1.0mL→摇匀；冰水浴中加入浓硫酸5.0mL→摇匀→沸水浴中加热10min→冷却至室温后于490nm处测定吸光度A；以吸光度A对浓度C进行线性回归，得回归方程：A=13.257C-0.0021，R2=0.9993，线性范围0.01~0.07mg/mL。（2）换算因子的测定 精确称取干燥至恒重的娑罗子去蛋白多糖0.0100g→配成0.04mg/mL的多糖溶液→精确量取此多糖溶液2.0mL，空白为2.0mL纯净水，按照制作葡萄糖标准曲线的方法测其吸光值（n=3，RSD=0.66%）。按下式计算换算因子：f=W/(CD)，其中W为多糖质量（mg），C为多糖液中葡萄糖的浓度（mg/mL），D为多糖的稀释因素（mL），计算得f=1.990。（3）样品中多糖含量的测定 精确称取娑罗子干燥粉末0.500g→以乙醚为溶剂→采用索氏提取回流去脂至乙醚为无色；→挥干溶剂后→药渣置于三角瓶中→加纯净水90mL→微沸水浴中回流提取2h→脱脂面过滤→滤渣和脱脂棉一并放入三角瓶中→加90mL纯净水再提取一次→合并两次滤液定容至250mL容量瓶中→吸取此滤液2.0mL置于离心管中→加无水乙醇10.0mL→摇匀后10000r/min→室温下离心10min→弃去上清液→沉淀加适量水溶解→100% 功率室温下超声15min→溶液移至10mL容量瓶中→用纯净水洗涤离心管两次→洗液并入容量瓶中→定容，作为供试品溶液。参考《中华人民共和国药典》2005年一部玉竹多糖的含量测定方法。精确吸取此供试品溶液2.0mL→按照测定换算因子的方法测其吸光度值，按下式计算多糖含量，多糖含量（%）=（CDf/W）x100%，其中C为供试液中葡萄糖浓度（mg/mL），D为多糖的稀释因素，f为换算因子，W为供试药材娑罗子的质量（mg）。3. 源森生物娑罗子多糖体外抗氧化活性的测定（1）对羟自由基（·OH）清除率的测定 采用邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+产生的羟自由基。取0.75mmol/L的磷二氮菲溶液1.0mL→再依次加入150mmol/L的磷酸盐缓冲液（PH=7.4）1.5mL→0.75mmol/L的FeSO4溶液1.0mL→0.01%的H2O21.0mL→每加一管立即混匀→最后以纯净水补充总体积至10.0mL。 粗多糖、去蛋白多糖及VC溶液清楚.OH的作用，依上述方法分别加入不