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快速宽场显微光切片成像技术分析及研究进展 　　摘要：本文描述了目前流行的几种基于宽场显微镜的快速光切片成像技术和装置，包含非干涉测量的宽场光切片技术、基于变形光栅的实时三维成像宽场显微切片技术、基于微条纹阵列LED的显微光切片技术、基于变焦透镜的宽场显微光切片技术。通过对这几种技术的分析，找到他们的优缺点，充分发挥技术的优势和应用范围，同时也对这些技术提出了更高的要求。对宽场显微镜的改造可更大限度的发挥它的优势，使其能广泛应用于生物医学成像及相关领域。 　　关键词：衍射光栅;变形光栅;变焦透镜 　　中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2015）45-0076-02 　　 伴随光学显微镜技术的飞速发展，显微技术也在相应的不断进步。经过有关光学系统及信息处理能够使显微镜的分辨率大幅提高，用于生物样品三维信息的获取、记录、处理和显示的显微镜成像系统也得到了很大发展。在显微镜成像过程中，其所获取的每一幅图像都包含了焦平面和焦平面外的光信息，焦平面外的信息对所成图像造成了很大的模糊干扰，因而使得图像清晰度降低甚至无法识别。为了去除这些离焦光信息，人们尝试了许多解决办法。激光扫描共焦技术在荧光显微成像的基础上克服了离焦平面信息的干扰，从而得到了清晰地聚焦平面的图像。但是其缺点也是很显然的：其价格昂贵不利于技术的普及;不能得到样品完整、真彩的图像;由于需作二维逐点扫描，其成像速度受到限制，不能对样品实施快速动态成像。宽场显微镜是一套传统的显微镜，其价格便宜，可广泛用于各种行业实现对样品的快速观测，为了实现对样品的三维观察，首先需要对样品进行光学切片，在基于宽场显微技术的基础上经过对显微镜的改进，可采用各种方法实现宽场显微镜的光学切片成像。随着对微观世界更深入的研究，人们希望进一步提高光切片质量和切片的速度等。本文将介绍几种基于宽场显微技术的快速三维成像技术。 　　一、非干测量的宽场光切片技术 　　细胞膜的活动在细胞的力学中扮演着重要的角色，因此观测细胞膜的三维结构是非常重要的。一般我们使用相衬和荧光显微镜技术去观察它的活动，然而这种光学观察只能提供细胞边界的信息，很难去了解细胞表面的拓扑结构。为了清楚实时地观察到生物样品的三维结构，这种仪器应该满足分辨率高、成像速度快、视野大等多种要求。在基于宽场显微光切片的技术基础上，可以采用一种新的光学技术――非干涉测量的宽场显微镜光学轮廓测量技术来实现这一要求。这一技术不需后期的扫描机制即可得到三维图像，系统中探针是浸入水的物镜，它的工作距离在毫米范围内。图1显示的是实验装置，该装置采用传统的光学显微镜作为主要的设备，使用一个功率固定的钨卤素灯作为光源，它的功率波动范围为小于1%，带通滤波片的波长范围为350～610纳米。这套系统使用栅格图案在空间相位0，2π/3，4π/3获得三幅图像，然后使用零查探测原理去删除这个栅格图案获得光学剖面图像，通过对图像的后期处理即可呈现样品的3D结构。 　　二、基于Z轴自动控制宽场光切片技术 　　在对细胞或者微小的样品进行观察时，显微镜是必不可少的工具，但是一般的显微镜包括宽场显微镜只能观察他们的二维图像，为了得到三维的图像，需要在显微镜的z轴方向上进行光学切片，得到不同焦平面的图像，然后利用计算机技术实现三维重构。为了在宽场显微镜中得到Z轴上不同的焦平面信息，需要对轴进行微调，Z轴方向每上升或者下降一定的距离获取一副图像。传统的方法是用手动的方式去调节Z轴的旋钮，达到Z轴上升或下降的目的。这种方式使得得到的断层扫描图像难以获得足够的精度和足够薄的切层厚度，而且各个断层图像的层厚变得不均匀，这样将在很大程度上影响图像的三维重构效果，同时在进行断层扫面时图像的拍摄时通过手动的方式控制拍摄，这样拍摄一副断层图像需时过长，在荧光样品拍摄前往往已经暴露在激发光的强光之下，这样大大增加了样品被强光漂白导致损伤的危险。因此，一种采用全自动宽场显微光切片的技术将具有重要意义。 　　这种技术能通过计算机控制显微镜物镜Z轴作精确的微动，来对样品进行逐层扫描成像，其精度可达到纳米级，同时它还能控制摄像系统对每层断层图像进行自动的摄取与存储，不需人工干预。因此，在光路中加装一套激发光快门开合系统，通过计算机同步控制快门开合系统和自动数码成像（或视频图像）拍摄系统，这些装置的增加对宽场显微光切片技术有着非常重要的意义。这样的一套系统可广泛应用于各种医学和生物研究领域，特别是需要观察三维断层的相关领域如生物医学成像与生物医学材料的领域，具有非常重要的实用价值。 　　三、变形光栅光切片技术 　　要想得到物体不同层的图像，传统的方法是移动透镜或者相机，但是在一些应用中物体或者成像条件是快速变化的，需要设备能在相同条件下同时捕获多