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常用培养基的制备、灭菌与消毒 中国食品工业信息网 实验三、菌种保藏 几种常用的保藏方法： 1、传代培养法 保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于厌氧细菌）培养好后，置4C?冰箱中存放，定期进行传代培养、再存放。 可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体石蜡来进一步延长保存期。 2、载体法 使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。 常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤纸片等。 3、悬液法 将细菌、酵母菌细胞悬浮在一定的溶液中保存。 溶液包括蒸馏水、糖溶液、磷酸缓冲液、食盐水等。 4、冷冻法 使菌种始终存放在低温环境下的保藏方法。包括低温法和液氮法。 此法关键是要克服细胞的冷冻损伤。注意控制降温速率及保护剂的使用。 5、真空干燥法 这类方法包括冷冻真空干燥法和L－干燥法。 冷冻真空干燥法是将要保藏的微生物样品先经低温预冻，然后在低温状态下进行减压干燥。 L-干燥法则不需要低温预冻样品，只是使样品维持在10－20C?范围内进行真空干燥。 操作方法 1、斜面保藏法 将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置4C?冰箱中包藏。 保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存2－4个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。 此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易被污染。 2、液体石蜡保藏法 将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1CM为准，使菌种与空气隔绝。 将试管直立，置低温或室温下保存。 此法实用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏1－2年，普通细菌也可保藏1年左右。 3、穿刺保藏法 按穿刺接种方式培养菌种，菌种长好后用胶塞封严，置4℃冰箱存放。 4、砂土管保藏法 （1）河砂处理 取河砂若干加入盐酸10% ，加热煮沸30min除去有机机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用40目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。 （２）土壤处理　 取非耕作层不含腐殖质的痩黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干后碾碎，用100目筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。 (3)砂土混合 处理妥当的河砂与土壤按3：1的比例掺合(或根据需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均匀后，装入10x100mm的小试管或安瓿管中，每管分装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌(通常采用间歇灭菌2--3次)，最后烘干。 (4)无菌检查 每10支砂土管随机抽1支，将砂土倒入肉汤培养基中，30℃培养40h，若发现有微生物生长，所有砂土管则需重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌后方可使 用。 (5)菌悬液的制备 取生长健壮的新鲜斜面菌种，加入2-3ml无菌水(每18x180mm 的试管斜面菌种)，用接种环轻轻将菌苔洗下，制成菌悬液。 (6)分装样品 每支砂土管(注明标记后)加入0．5ml菌悬液(刚刚使砂土润湿为宜)， 用接种针拌匀。 (7)干燥 将装有菌悬液的砂土管放入干燥器内，干燥器底部盛有干燥剂。用真空泵抽干水分后火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住试管口)。 (8)保存 置4℃冰箱或室温干燥处，每隔一定的时间进行检测。此法多用于产芽孢的细菌、产生孢子的霉菌和放线菌。在抗生素工业生产中应用广泛、 效果较好，可保存几年时间，但对营养细胞效果不佳。 二、基本原理 形态观察主要包括群体的形态和个体的形态观察。 细菌的基本形态主要分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类，近年还发现星状和四方形细菌等。细菌形态受培养时间、培养基成分、浓度、培养温度、培养时间等发生变化。 细菌菌落大多表面光滑湿润，有光泽，一般菌落较小，质地颜色均匀，同培养基结合不紧密。菌落特征与组成菌落的细胞结构、生长状况、排列方式、好气性和运动性直接相关。 细菌个体微小，较透明，必须染色方可呈现。根据细菌个体形态观察的不同要求