人促血管生成素2反义真核表达载体的构建及鉴定.pdfVIP

以科学发展理堤进科技创新(三) 669 crownProsthetDent．1998，80(4)：394～403 J 作者简介杨瑟E，西安交通大学材料科学与工程学院博士后，导师金志浩教授，研究方向：纯钛铸 COrOtcn： 人促血管生成素一2反义真核表达载体的构建及鉴定 朱鹏1 郑朝新‘ 陈道达2 1．成宁医学院外科，湖北，成宁，437100； 2。华中科技大学同济医学院附属协和医院普外科，湖北武汉，430022 摘要 方法：应用基因重组技术将Ang一2eDNA反向克隆到真核表达载体pEGFP—N1中。结果： Xholl、BamhI双酶切后，反叉重组基因为54kb和0726kb两条带，与理论计算相符。结论： 成功构建人促血管生成素(Ang一2)真核表达栽体，为肿瘤细胞的Ang一2反叉基凶治疗研究 创造了条件。 关键词促血管生成素反叉真核栽体 胃癌 构建 促血管生成素一2是位于血管内皮细胞上的特异性酪胺酸酶受体Tie一2的天然配体，已发现Ang 化，维持血管稳定性和渗透性方面起到重要作用，Ang一2是Ang一1的天然受体竞争性拮抗剂。本实 验旨在构建反义人促血管生成素一2真核表达载体，为进一步研究Ang一2在肿瘤基因治疗中的作用创 造条件。 一、材料和方法 1。实验材料 大肠杆菌DH5a由华中科技大学同济医学院附属协和医院普外科实验室保存，质粒pEGFP—N1 合酶、PCR产物回收试剂盒、质粒提取试剂盒自购。质粒pEGFP—N1图谱如下(图1)。 2．Ang一2eDNA的制备 总RNA，DEPC处理的三蒸水溶解，一20C冻存。利用逆转录酶AMVl 0pL将2,ugTRNA在RT反应 体系中将其逆转录成eDNA。 3．引物设计及目的基因扩增 GCCAGGATcCCCCCA(：TGTTGCTAAAGAAGA一5’ 一 3。． 下游引物 670 ========!———j———$———$———#———#——————————————————一—— 一兰竺兰苎垦竺堡兰竺型兰兰—— 图1质粒pEGFP-N·图谱 cDNA2 0ttL作模板 限制性内切酶Xh011，Bamhl酶切位点。取引物1上下游引物各0．5pL以Ang一2 4．质粒pEGFP—N，的大量制备和纯化 5．酶切 浴)，将酶切产物用1％琼脂糖电泳，按提取试剂盒说明回收DNA片段，去离子水溶解，一20(2冻存 备用。 6．连接反应 过夜。 7．质粒转化和克隆挑选殛鉴定 用氯化钙法制备DH5a感受态并按常规方法将连接产物转化感受态，将2001-L转化后的菌液涂于 过夜。质检提取试剂盒提取质粒，根据重组质粒图谱，用Xholl，Bamhl双酶切初步鉴定。最后通过测定 重组质粒中的Ang一2eDNA片段的碱基序列来完成最终鉴定(测序由上海博亚公司完成)。 二、结果 位置与所预制期(1319bp)的相符(图2)。 bp) 671 以辩学发堤税促进科技创新(三) =-———————————————————————————